[发明专利]一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种非诊断目的的利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建多条通用Barcode片段，所述Barcode片段为使用前引物和后引物扩增YFP DNA得到，所述前引物中包括bridge片段及Barcode1片段以及YFP上的一段序列，所述后引物中包括Barcode2片段及reverse片段以及YFP上的一段序列；以黄色荧光蛋白YFP片段DNA为模板，利用所述前引物和后引物进行PCR扩增YFP DNA，得到Barcode片段；

针对待测SNP位点设计一对普通引物，其中前引物距离SNP位点在150bp内或者后引物距离SNP位点在36bp内，且后引物需要在其5’端加上bridge片段，所述后引物中的bridge片段与构建Barcode片段中所使用的bridge片段反向互补；以样品DNA为模板，利用设计的引物进行SNP片段扩增；

将各样品对应的上述扩增的Barcode片段和SNP片段做混合模板，进行overlappingPCR扩增，获得用于测序的完整片段；所用正向引物为SNP位点的前引物，所用反向引物为reverse片段的反向互补序列；

将获得的待测序片段混合后进行纯化；

纯化后的产品建库并进行二代测序；

数据分析，得出基因分型结果。

2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：针对384个待测样本设计24种包含不同Barcode1序列的前引物以及16种包含不同Barcode2序列的后引物；涉及的前引物序列见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示；涉及的16种后引物序列见SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对。

3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：进行SNP片段扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点的基因型，则引物F和R分别加入0.8ul；检测2个SNP位点的基因型，则引物F和R分别混合后各加入1ul；检测5个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入2ul；检测20个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入3ul。

4.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：进行overlapping PCR扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点，则引物F加入0.8μl；2个SNP位点则引物F_mix加入1.2μl；5个SNP位点则引物F_mix加入1.5μl；20个SNP位点则引物F_mix加入2μl；反向引物EndR所加量均为0.8μl。

5.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于：所述纯化包括磁珠纯化。

6.一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，其特征在于：包括多条通用Barcode片段，所述Barcode片段为使用前引物和后引物扩增YFP DNA得到，所述前引物中包括bridge片段及Barcode1片段以及YFP上的一段序列，所述后引物中包括Barcode2片段及reverse片段以及YFP上的一段序列；2X Phanta Master Mix，2X Taq Plus Master Mix。

7.根据权利要求6所述的一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，其特征在于：所述前引物见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示，所述后引物序列见SEQ ID NO.25-SEQ IDNO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对，所述试剂盒可组成384个不同的引物对。

8.根据权利要求7所述的一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测方法如权利要求1-5任一所述。