[发明专利]一种将枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的方法

说明书

本发明公开了一种将枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的方法，通过基因工程的方法，对枯草芽孢杆菌进行改造，得到可用于生产纳米抗体的多功能稳定的平台，同时也可进一步将工程化后的枯草芽孢杆菌制为芽孢保存备用。相较于大肠杆菌法和LCE法，本发明中生产纳米抗体的方法，具有所得产品的毒素水平低、纯化工艺更简单、生产规模易于扩大、可长期保存以及在极端环境下进行生产等优点。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体是一种利用枯草芽孢杆菌生产纳米抗体的方法。

背景技术

纳米抗体是1993年由比利时科学家在羊驼体内发现的，存在于骆驼外周血液中的一种特殊抗体，因仅由一个最小抗原结合片段的结构域组成，含有天然重链可变区域，分子的长度在纳米级别而得名。

这种源自骆驼科动物的单链可变抗体片段的纳米抗体，与单克隆抗体相比，小分子纳米抗体的制备相对容易和简单。此外，由于纳米抗体易于进行基因操作，从而可以形成单价、双价、双特异及多价抗体，形成融合蛋白进行靶向治疗，同时由于纳米抗体具有分子量小，可溶性高，亲和力好，相对稳定，穿透力较强等优势，纳米抗体在全身成像和开发用于治疗多种疾病(包括但不限于炎症，癌症，骨骼疾病，血液学和传染性疾病)的新药物中已证明具有翻译潜力，在临床治疗与诊断，医药研发及食品科学等领域均具有较广阔的前景及应用。

生产包括纳米抗体在内的各类生物制剂的主力为细菌，酵母，植物和哺乳动物细胞之类的活细胞系统，但是，大肠杆菌的细胞内表达来生产纳米抗体这种方法需要漫长的步骤来释放细胞内蛋白质以进行纯化以及去除内毒素，大大延长下游的加工时间。近几年，从活细胞制备的冻干细胞提取物(LCE)使药物生产分散化和室温储存成为可能，可作为上述方法的备选方案，但是细胞提取物不能复制，因此难以扩大规模；一些LCE系统使用大肠埃希氏菌，因此必须采取严格的程序去除内毒素污染；细胞裂解物中蛋白质和小分子的混合物需要大量的下游产物纯化；在无细胞蛋白表达系统中存在批次间的变异性。

枯草芽孢杆菌的内毒素水平极低，可显著简化下游纯化步骤，但枯草芽孢杆菌在表达外源蛋白的同时，自身也会向胞外分泌大量的蛋白酶，使外源蛋白无法稳定存在。很多真核蛋白在枯草芽孢杆菌中的Sec依赖性分泌途径产生的质量较差，虽然已经开发出相应的菌株来减轻该问题，但是由于目标蛋白的错误折叠使得分泌的某些真核蛋白仍存在质量问题。

发明内容

本发明使用枯草芽孢杆菌作为微生物工厂生产纳米抗体，属于大肠杆菌法和LCE法生产纳米抗体的可替代方案，在解决了现有种种问题，如目标蛋白错误折叠而导致产品蛋白的质量及产量下降等，该方法更具优势：枯草芽孢杆菌所含的毒素水平低，下游的纯化工艺更简单，且生产规模易于扩大；将含有纳米抗体融合基因的枯草芽孢杆菌转化为芽孢，可以稳定地长期保存，且可在极端环境下进行生产等。

本发明具体采用的技术方案为：

将枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的步骤如下：

A1：构建融合基因：所述融合基因包括纳米抗体的DNA序列、用于融合蛋白检测的FLAG肽(DYKDDDDK)和用于在含三乙酸(NTA)的层析柱上进行金属亲和层析的6×组氨酸标签(His标签)；合成DNA片段，并对编码所述DNA片段的密码子进行优化；

A2：扩增所述DNA片段，并纯化，得到扩增产物；

A3：将所述扩增产物组装至质粒中，得到重组质粒；

A4：将所述重组质粒转移至大肠杆菌中后，在35～40℃下继续培养10～18h，对细菌进行筛选，得到初次筛选细菌；

A5：将所述初次筛选细菌接种于培养基中，并在35～40℃下继续培养12～18h，分离得到表达质粒；

A6：将所述表达质粒转移至枯草芽孢杆菌中，继续孵育2～3h后，在35～40℃下过夜培养，对细菌进行筛选，得到二次筛选细菌；