[发明专利]一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用

权利要求书

1.一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用Ribosome profiling技术，通过超高速梯度密度离心，分离核糖体-RNA复合物；分离纯化RNA；构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序。

2.根据权利要求1所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序步骤包括利用带Oligo dT的磁珠提纯mRNA，然后基于SMART反转录原理进行RNA反转录；之后，获取cDNA双链；Tn5酶切，富集RNA 3’端；以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库；测序，间接量化蛋白表达水平。

3.根据权利要求2所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的引物序列包括：

Ad1 cgacgtaccagattacgctcc/rG//rG//rG/；

Ad2-1 ccgcacgctaactagtgtcgCTGATCGTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-2 ccgcacgctaactagtgtcgACTCTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-3 ccgcacgctaactagtgtcgTGAGCTAGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-4 ccgcacgctaactagtgtcgGAGACGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-5 ccgcacgctaactagtgtcgCTTGTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-6 ccgcacgctaactagtgtcgTTCCAAGGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-7 ccgcacgctaactagtgtcgCGCATGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-8 ccgcacgctaactagtgtcgACGGAACANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-9 ccgcacgctaactagtgtcgCGGCTAATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-10 ccgcacgctaactagtgtcgATCGATCGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-11 ccgcacgctaactagtgtcgGCAAGATCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

Ad2-12 ccgcacgctaactagtgtcgGCTATCCTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。

4.根据权利要求3所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的反应体系包括：2.75ul RNA，0.5ul Ad2引物(50uM)，0.5ul dNTP(10mM)；置于65℃变性5分钟，然后放回冰上超过1分钟；之后，向其中加入RNase inhibitor(40U/ul)0.25ul，SuperScript IV first-strandbuffer(5X)2ul，DTT(100mM)0.5ul，Betaine(5M)2ul，氯化镁(1M)0.06ul，Ad1引物(50uM)1ul，SuperScript IV reverse transcriptase(200U/ul)0.5ul；所述Ad2引物为权利要求3中所述的Ad2-1至Ad2-12引物中的一条。