[发明专利]一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用

说明书

本发明公开一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用，外泌体miRNA分子标志物包括oar‑miR‑22‑3p和chi‑miR‑378‑3p，该种miRNA分子标志物在早期妊娠的母羊血清外泌体中呈现高表达，单独使用血清外泌体miRNA诊断区分早期妊娠与未妊娠母羊时，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.891(0.728，1.000)、0.922(0.791，1.000)；联合诊断区分早期妊娠与未妊娠母羊时，其AUC(95％CI)为0.984(0.936,1.000)，可见，本发明提供的外泌体miRNA分子标志物在早期母羊妊娠诊断中具有高灵敏度及高特异性，使用多个miRNA标志物联合，具有优越的诊断性能。

技术领域

本发明属于生物技术诊断领域，具体的，本发明涉及一种用于母羊妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用。

背景技术

外泌体(Exosomes)是细胞产生释放到细胞外环境大小为30-100nm的囊泡，普遍存在于动物的唾液、血液、尿液及乳汁等流体中。MicroRNAs(miRNA)是短链非编码RNA，其长度约为19-2两种核苷酸，通过与mRNA的3'-UTR区内部分或全部序列互补发挥调控作用，导致靶基因转录抑制，从而参与动物的胚胎发育。miRNA存在于外泌体的独特形式使之成为理想的生物标志物。研究表明，Exosomes作为细胞外miRNA的一种运载形式，可以保护其内miRNA免受核糖核酸酶的降解，使得miRNA在Exosomes中高度稳定表达。Exosome中的miRNA拥有独特的介导细胞间通信的作用，可以特异性抑制细胞中与其对应靶基因的表达。Exosomes中miRNA的在体液中独特稳定性和时空特异性使之成为理想的新型标志物逐渐进入人们的视野中。

母羊的妊娠诊断一直以来都受到企业的重视，因为早期妊娠的准确诊断不仅能减少母羊空怀所造成的经济损失，而且便于及时对妊娠母羊进行及时分群，合理的饲养和管理，同时也有利于提高绵羊繁殖效率，促进家畜集约化管理，提高效益。如何通过有效而准确的诊断方法发现未妊娠母羊，缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)一直困扰着养羊业。

现有的妊娠诊断方法存在着各自的缺陷，如超声波诊断受使用者的经验程度及其检测天数较长的影响；依据母羊发情周期以及妊娠征状诊断，可能会存在假发情现象；激素测定则存在一定的危险性。鉴于以上诊断方法存在的缺陷，我们迫切的需要找到一种更为简单准确的妊娠诊断方法应用于生产管理。

目前关于母羊妊娠早期妊娠外泌体miRNA的研究较少，普遍存在特异性和灵敏度低、诊断价值低的问题，如何通过研究外泌体miRNA，对血清外泌体miRNA作为妊娠诊断分子标志物的研究对养殖业具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物的特异性和灵敏度低、诊断价值低的技术问题，本发明旨在于提供一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物，通过采用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，收集17天配种妊娠与未妊娠母羊外周血样本，从而对妊娠与未妊娠母羊样本中差异外泌体miRNA进行筛选，最终获得了两种与母羊早期妊娠密切相关的外周血中外泌体miRNA，即oar-miR-22-3p和chi-miR-378-3p，选择两种外泌体miRNA中的任意一个或两种以上的组合，在妊娠与未妊娠血清样本中进行表达并通过Real-time PCR验证，最终证明本发明提供的oar-miR-22-3p和chi-miR-378-3p与母羊早期妊娠高度相关，能够作为快速检测母羊早期妊娠的标志物，该种血清外泌体miRNA标志物具有良好的诊断指标的特性。

本发明中，oar-miR-22-3p和chi-miR-378-3p的RNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2所示：

SEQ ID NO.1：AAGCUGCCAGUUGAAGAACUG；