[发明专利]烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8及其应用

说明书

本发明公开了一种烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8及其应用，所述烟草丝裂原活化蛋白激酶NtMAPK8基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示；本发明首次克隆烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8，并构建得到了克隆载体及通过基因编辑载体构建NtMAPK8基因缺失的转基因突变株，从而使烟草叶片颜色由正常的绿色变成花白；因此可以利用基因编辑载体使NtMAPK8基因不表达，进行植物品种育种，获得植物花叶的观赏植物品种。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8及其应用。

背景技术

在植物中，烟草是重要的一种经济作物。烟草叶片的颜色，直接影响烟草烘烤后的烟丝色泽，其为衡量烟叶品质的一个重要指标。

MAPKKK-MAPKK-MAPK级联途径在植物中非常保守，其不仅在植物的防御系统中扮演着重要的角色，还在植物的生长发育中也起着十分重要的调节作用。但是目前尚未有MAPK基因在叶片颜色方面的相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8，其如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示。

本发明另一目的是提供含有上述的烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8的重组载体。

本发明所述的重组载体包括克隆载体和表达载体；所述的克隆载体的制备方法包括以烟草的cDNA为模板，用如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物，进行PCR扩增；将所得PCR产物连接到T载体上，转化大肠杆菌获得克隆载体。

本发明另一目是提供一种基因敲除载体，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtMAPK8基因设计靶位点后基因编辑获得，所述靶位点敲除序列的核苷酸序列如SEQID NO:7所示；在所述靶位点两侧加上人工合成的接头序列后得到的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；将所述引物对经退火后，连接到经BsaI酶切的载体pORE-Cas9上，获得基因敲除载体pORE-Cas9/NtMAPK8。

本发明另一目是提供一种转基因植物，所述转基因植物的制备方法包括：将基因敲除载体pORE-Cas9/NtMAPK8转化农杆菌感受态细胞，再转化侵染植物即得。

所述转基因植物为转基因烟草；转化侵染转基因烟草时采用pORE-Cas9/NtMAPK8载体转化农杆菌感受态，利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法对烟草进行遗传转化，获得不同颜色的烟草植株。具体地，其叶片颜色部分由绿色变成浅绿色。

本发明另一目是将上述的烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8应用在制备不同叶片颜色植物品种中。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

本发明首次克隆获得烟草丝裂原活化蛋白激酶基因NtMAPK8，并构建得到了克隆载体及敲除载体；NtMAPK8蛋白参与MAPK信号传递，可通过基因编辑载体构建NtMAPK8基因缺失的转基因突变株，从而使烟草叶片颜色由正常的绿色变成花白，具体原因仍然不清楚。