[发明专利]一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用

说明书

本发明涉及一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用，首先从健康虹鳟肠道中筛选鉴定获得枯草芽孢杆菌RT‑BS07株，对菌株的生物学特性进行了分析，并通过体内试验评价其对虹鳟的促生长和抗感染等方面的益生功能。本发明所得RT‑BS07株具有安全、耐酸耐盐、能较好粘附在宿主肠道上、能抑制致病菌生长的特点；能有效促进虹鳟体长、体质量、脾脏重量和肠道长度的增长；能有效提高虹鳟相关组织中免疫和消化相关酶活性；能有效促进虹鳟相关组织中生长及免疫相关基因的上调表达；能提高虹鳟机体抗感染能力，经嗜水气单胞菌攻毒感染后，实验组死亡率比对照组低30％。

技术领域

本发明涉及一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

益生菌源于希腊文Probiotics一词，是“共生”的意思，意味着“在动物之间的生命维持上起到相互补益的作用”，与Antibiotics(抗生素)相对立。具体来说，益生菌是通过定植在生物体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于宿主健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。

水产益生菌具有增强鱼体免疫机能、抑制病原微生物和提高饲料利用率等作用。已有研究表明，益生菌如乳酸菌、芽孢杆菌等可有效调控肠道菌群结构，维持肠道微生态动态平衡，提高鱼体非特异性免疫机能，激活鱼体细胞和体液免疫系统，增强对各种疾病的抵抗能力；同时，益生菌在预防和控制鱼类传染性疾病方面具有重要作用，可通过改变宿主体内的微生物菌群组成，阻断或抑制致病菌在肠道黏膜上黏附、定植和繁殖，其代谢产物亦可限制病原菌的生长；此外，益生菌在调控水质、提高饲料利用率等方面也有重要作用。

目前，我国虹鳟的病害防治主要依赖抗生素等化学药物，容易对生态、环境及食品安全等方面造成不良影响。因此，国内外科学家致力于各种抗生素替代品的研究，绿色环保的益生菌成为研究热点，且益生菌的效果已在鲤鱼、罗非鱼、虹鳟等多种鱼类中得以证实。

由于种质、生境及饲养条件等差异，国外研发及商品化益生菌在我国虹鳟养殖中的现实应用具有一定的局限性和不适应性，不能得到较好的效果和推广。立足我国养殖现状，分离、筛选适用于我国虹鳟养殖应用的益生菌菌株已成为目前迫在眉睫的重要工作之一。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用，首先从健康虹鳟肠道中筛选鉴定出枯草芽孢杆菌RT-BS07株，对菌株的生物学特性进行研究，并通过体内试验评价RT-BS07株对虹鳟促生长及抗感染等方面的益生功能。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)RT-BS07，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019916，保藏日期：2019年11月11日。

所述的枯草芽孢杆菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)在无菌条件下，对虹鳟体表进行消毒，解剖获取虹鳟肠道组织，用无菌磷酸盐缓冲液PBS冲洗，采用组织匀浆器破碎肠道组织，得到组织匀浆液，将组织匀浆液收集于1mL无菌生理盐水中，梯度稀释后取100μL涂布于选择性培养基表面，于恒温培养箱中28℃倒置培养；挑取平板上的单菌落，通过划线培养法进行纯培养，直到获得纯培养物，将纯培养物接种到LB液体培养基内，28℃摇菌扩大培养18h，将所得菌液保存于18％的灭菌甘油内，-80℃冷冻保存；

(2)采用分子生物学方法对菌株进行种属鉴定，选取16S rDNA作为目标基因，选择引物进行PCR扩增，结合理化特性分析，鉴定菌株属于枯草芽孢杆菌，并命名为枯草芽孢杆菌RT-BS07。