[发明专利]一种PCCI-2U质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种pCCI-2U质粒，其特征在于，包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、可经诱导使质粒拷贝数提高至10个拷贝的oriV复制子、抗生素抗性基因以及原核转录终止子T3te和tonB，所述原核转录终止子T3te和tonB位于克隆位点两端；

所述pCCI-2U质粒中，自5’端第1bp～30bp为终原核转录终止子T3Te，58bp～135bp为多克隆位点区域，155bp～186bp为原核转录终止子tonB，200bp～1156bp为Trp基因，1901bp～3243bp为2μ复制子基因，3388bp～4047bp为氯霉素基因，5008bp～5622bp为oriV基因，6008bp～6763bp为repE基因，7342bp～8517bp为sopA基因，8517bp～9488bp为sopB基因，9561bp～10034bp为sopC基因。

2.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其特征在于：所述PCCI-2U质粒包括trp基因和yeast 2μ复制子基因，所述PCCI-2U质粒在酵母中以高拷贝的特点维持，所述PCCI-2U质粒具有编码色氨酸的TRP基因。

3.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其特征在于：所述抗生素抗性基因编码氯霉素乙酰转移酶的Cm基因。

4.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其特征在于：所述PCCI-2U质粒在大肠杆菌中的拷贝数维持在一个拷贝，转换具有trfA gene的大肠杆菌，通过诱导剂诱导提高拷贝数至10个以上拷贝。

5.一种构建权利要求1～4任一所述PCCI-2U质粒的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：分别设计并人工合成SEQ ID NO.1所示序列结构的trp-酵母复制子2μ基因序列、SEQ ID NO.2所示序列结构的CmR-ori2基因序列、SEQ ID NO.3所示序列结构的repE-sopC基因序列、SEQ ID NO.4所示的原核转录终止子和多克隆位点基因序列；

步骤二:运用Gibson重组方法将步骤一中的4个基因序列连接环化，最终得到环形质粒。

6.如权利要求4所述PCCI-2U质粒的方法，其特征在于，所述trp-酵母复制子2μ基因序列、CmR-ori2基因序列、repE-opC基因序列、原核转录终止子和多克隆位点基因序列之间具有30bp-40bp的重叠互补区。

7.如要求1～4所述的PCCI-2U质粒在基因克隆、基因合成、测序领域中的应用。