[发明专利]一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法和应用

说明书

本发明公开了一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法和应用，涉及植物组织培养技术领域，包括从软枣猕猴桃植物上剥取休眠芽，放入预培养培养液中预培养1‑5d；无菌条件下，将休眠芽转入冻存管，常温下装载10‑60min，于0℃下用玻璃化液处理90‑150min，加入少量新鲜的玻璃化液后迅速投入液氮中，冻存；取出后立即水浴解冻，用MS卸装液洗涤卸装，干燥后转至恢复培养基，暗培养1‑3d后置于光下培养；本发明的方法所用材料来源于软枣猕猴桃品种，操作简单、有效，不需特殊仪器和繁琐的处理工序，超低温保存后扁桃恢复生长良好，成活率可达86.30％，是一种可靠的方法。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法和应用。

背景技术

软枣猕猴桃(Actinidia arguta Sieb.et Zucc.)为我国珍贵的抗寒果树资源，系猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)的大型落叶藤本植物。软枣猕猴桃抗性极强，且营养丰富，富含维生素C，具有重要的营养价值和经济价值，是猕猴桃属中具有重要利用价值的物种之一，是猕猴桃品种改良的重要种质资源。近年来由于清林抚育及人为掠夺式的采摘，使得大量野生软枣猕猴桃优异资源流失。为了保存珍贵的种质资源，有些科研部门和生产单位相继建立了软枣猕猴桃种质资源圃，进行圃地活体种植保存，但是由于土地和资金有限，保存的资源较少；有些单位进行组织培养保存大量资源，但是由于继代次数的增加，组培种质材料可能存在积累变异的风险；而近年来发展起来的超低温保存技术，设备简单，保存材料数量大，能避免产生积累变异的风险，很多植物都建立了超低温保存库，保存了成千上万份珍贵种质资源。

超低温保存是离体培养基础上发展起来的资源保存技术，指在液氮条件下(-196℃)对植物器官、组织、细胞等进行保存的一种生物学技术。在该温度条件下，植物材料细胞内的生长及代谢活动基本停止，处于一种相对稳定的生物学状态(“生机停顿”状态)，这样可以极大程度地减缓甚至终止代谢衰老过程，并保持材料的遗传稳定性，从而达到长期保存的目的。因此，超低温保存被视为植物种质资源长期保存最理想、最有效的方法。Sakai等建立的玻璃化法是一种设备简单，材料处理步骤简便，效果和重复性好的简单高效的超低温保存方法。休眠芽是植物为适应严寒的环境形成的一种保护性器官，经过了自然的低温驯化，提高了超低温保存后的成活率。迄今，利用玻璃化法已经成功保存了苹果、柿、扁桃等植物的休眠芽，但将这些方法直接应用于软枣猕猴桃，成活率极低，可见玻璃化法中的处理方式以及处理时间，不同物种间存在很大差异。关于软枣猕猴桃休眠芽的玻璃化超低温保存技术报道较少。1995年通过吉林省作物品种审定委员会审定的软枣猕猴桃品种‘魁绿’，是中国农业科学院特产研究所经过10余年选育的优良品种，抗逆性极强，可在-38℃安全越冬，生长季无严重病虫害。

发明内容

本发明的目的是提供一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用玻璃化法对软枣猕猴桃‘魁绿’休眠芽进行超低温保存研究，通过研究预培养、装载、玻璃化保护液、恢复培养基等超低温保存过程中的影响因素，建立了高效的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化法超低温保存体系，以期为软枣猕猴桃种质资源的长期保存提供参考依据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：

(1)从软枣猕猴桃植物上剥取休眠芽，放入预培养液中预培养1-6d；

(2)无菌条件下，将休眠芽常温下装载10-60min，于0℃下用玻璃化液处理30-300min，加入少量新鲜的玻璃化液后迅速投入液氮中，冻存；

(3)取出后立即水浴解冻，用MS卸装液洗涤卸装，干燥后转至恢复培养基，暗培养1-5d后置于光下培养。

进一步地，步骤(1)中，从软枣猕猴桃植物上剥取休眠芽前，需进行灭菌，具体步骤包括：