[发明专利]表达新型冠状病毒S蛋白的口服重组酵母及其制备与应用

权利要求书

1.一种新型冠状病毒S蛋白的截断体，序列特征为SEQ ID No.1，为包含第330位至521的RBD结构域和第816至833位FP融合肽。

2.表达权利要求1所述蛋白截断体的基因，其特征在于，包含刺突蛋白S的RBD结构域,即从第991位至1563位碱基和FP结构域，即从第2449位至2499位碱基，其核苷酸序列为SEQID No.2。

3.质粒GPD-S(RBD-FP)-TU，序列特征为SEQ ID No.3，由权利要求2所述基因片段和POT-GPD-TU载体组成。

4.制备新型冠状病毒S蛋白重组酵母的方法，其特征在于，将权利要求3所述体外构建的S蛋白截断体完整转录单位GPD-S(RBD-FP)-TU，通过同源重组整合于酵母基因组，利用Aga1-Aga2表面展示系统将S蛋白展示于酵母细胞表面，获得S蛋白表面展示型的重组酵母菌株ST1814G- S(RBD-FP)，并利用所得菌株制备口服重组酵母。

5.根据权利要求4所述制备新型冠状病毒S蛋白重组酵母的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1) SARS-CoV-2刺突蛋白S编码基因的PCR扩增：参考SARS-CoV-2病毒基因序列NC_045512.2，合成S基因，序列特征为SEQ No.2；以pcDNA3.1-CoV-S质粒为模板，设计引物扩增S蛋白编码基因S(RBD-FP)用于酵母载体连接；

(2) Aga2基因与SARS-CoV-2刺突蛋白S编码序列S(RBD-FP)串联：通过BamHI单酶切线性化POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接S基因片段至表面展示表达载体GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-S(RBD-FP)-TU，其序列特征为SEQ No.3，重组质粒转化至E.coliDH5a中，用S基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；

(3) S蛋白酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-S(RBD-FP)-TU与同源臂URRs、筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含S基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Westernblot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证。

6.权利要求4所述方法制备得到的表达新型冠状病毒S蛋白的重组酵母。

7.权利要求6所述的新型冠状病毒S蛋白的重组酵母在制备用于抗新型冠状病毒药物中的应用。