[发明专利]一种核酸适体功能化NK细胞及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种用于近红外引导下免疫/光热时序协同治疗肝癌的核酸适体功能化NK细胞及其制备与应用。本发明通过糖代谢途径将核酸适体共价偶联于NK细胞膜表面(G‑NK)，赋予其对肝癌的靶向作用；利用G‑NK细胞负载近红外荧光/光热转换分子ICG，构建免疫/光学时序性治疗载体系统(ICG@G‑NK)；以ICG作为分子影像探针，实现近红外荧光监测G‑NK细胞对肿瘤的富集，进而精准获取肿瘤的位置信息；在实现G‑NK细胞介导的免疫治疗后，启动光热治疗(PTT)，进一步杀伤残存肿瘤细胞；同时PTT可破坏实体瘤的致密组织结构，进一步促进G‑NK细胞富集和浸润，达到免疫/光学时序性协同治疗肝癌的目的，这将为NK细胞用于肝癌的综合治疗提供新策略。

(一)技术领域

本发明涉及一种核酸适体功能化NK细胞，及其制备方法以及在制备肝癌过继性免疫治疗药物中的应用。

(二)背景技术

根据国家癌症中心发布的《2019中国最新癌症报告》显示：我国新增癌症病例中，肝癌发病人数位列第四，死亡率排名第二，严重威胁着我国人民的生命健康及生活质量。尽管目前肝癌治疗以手术切除为主，辅以放疗、介入治疗等综合治疗手段，获得了一定的治疗效果，但预后仍较差，肝癌患者的远期生存率仍较低。

基于NK细胞的过继性免疫治疗是一种不依赖于抗原预先致敏而直接识别与攻击肿瘤细胞的免疫细胞治疗策略。NK细胞具有良好的杀伤肿瘤细胞特性，通过分泌TNF-α、IFN-γ、颗粒酶及穿孔素等细胞因子诱导肿瘤细胞凋亡或坏死。NK细胞不需要抗原预先致敏就能直接识别和攻击肿瘤细胞，并且NK细胞具有良好的组织浸润能力能够快速浸入肿瘤组织内部，因此受到业界普遍关注。但是NK细胞缺乏肿瘤特异性靶向能力及其体外扩增效率较低，限制其更深入的临床运用。基因工程/嵌合抗原受体改造的自然杀伤性细胞(CAR-NK细胞)能够通过其表面表达的scFv片段特异性识别肿瘤细胞，促进NK细胞向肿瘤部位富集，是提高NK细胞靶向能力的有效手段之一。但是，由于实体肿瘤组织间质致密以及免疫抑制微环境导致免疫治疗效果有限，以及CAR-NK细胞存在制备工艺复杂、成本昂贵等问题，极大的限制了其临床推广应用。

多手段联合治疗是提高肝癌治疗疗效的重要策略。免疫细胞治疗与光热治疗具有天然的联合和协同治疗基础，将其联合能够有效提高实体肿瘤的治疗效果。光热治疗(Photo Thermal Therapy，PTT)是利用近红外光照射，促使光热转换物质(如ICG、PDA等物质)将光能转化为热能，导致肿瘤细胞受热坏死的治疗手段。它具有无创、选择性高、无肿瘤耐药性等优点，能够在肿瘤免疫抑制微环境下发挥肿瘤治疗效果，并打破实体肿瘤致密的组织结构，进而吸引免疫效应细胞进一步浸润肿瘤组织，实现对残存肿瘤细胞的免疫杀伤。

当前免疫治疗联合光热治疗的策略主要是通过将光热转换物质包裹在各种肿瘤靶向/响应的纳米材料中使其靶向富集于肿瘤部位进行光热治疗，再辅助回输免疫效应细胞，从而形成简单的联合治疗方式。该联合治疗方式依赖于复杂的具有肿瘤靶向富集、成像、光热转换性能的纳米材料，两者之间难以真正有效协同，且存在纳米材料的长期安全性、免疫细胞肿瘤部位富集动力学不清楚等诸多问题，距离临床应用遥远。

兼具荧光成像功能的免疫/光热联合治疗更具临床转化与应用优势，首先，荧光成像具有较高的时间和空间分辨率，能够实时动态、可视化监测免疫细胞在肿瘤部位富集，进而精准为光热治疗提供肿瘤的位置信息；其次，免疫细胞在肿瘤部位富集与光热转换物质体内代谢都具有一定的时效性，准确判定最佳光照时机能够进一步提高免疫/光热联合治疗效果。

(三)发明内容

为了解决上述技术难题，本发明提供了一种用于近红外引导下免疫/光热时序协同治疗肝癌的核酸适体功能化NK细胞，及其在在制备肝癌过继性免疫治疗药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种核酸适体功能化NK细胞，由如下方法制备获得：

(1)制备PBMC细胞，与滋养细胞IL21-K562共培养，获得体外激活扩增NK细胞；