[发明专利]草木樨LTR-RT和miRNA-SSR分子标记引物及在种质鉴定中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及草木樨LTR‑RT(长末端重复反转录转座子)、miRNA‑SSR分子标记引物及在草木樨属种质鉴定中的应用。具体分别采用47对LTR‑RT引物或66对miRNA‑SSR引物对草木樨属18个种40份种质进行区分，两种方法均可利用较少的引物组合在短时间内完成对供试草木樨属种质的比对鉴定，具有准确、高效、快速、成本低以及操作方便等优势，两种方法均具有较高的灵敏度和精确度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及草木樨分子标记引物(包括LTR-RT分子标记引物和miRNA-SSR分子标记引物)及在草木樨属种质鉴定中的应用。

背景技术

白花草木樨(Melilotus albus)是豆科草木樨属一年生或两年生牧草，栽培面积仅次于紫花苜蓿(Medicago sativa)，适宜在湿润和半干燥气候地区生长。其具有生命力强、耐干旱、耐贫瘠、耐寒冷、生长快等特点。在苜宿难以生存的地方，仍能良好生长。全属植物约19种，主要分布于中亚、欧洲和北非。我国有7种。该属植物经济价值较高，是优良的牧草和中国北方农业和畜牧业极为重要的绿肥作物；此外，草木樨中主要有效成分为香豆素，具有生物活性，可作为一种烟草香料；在民间常制成软膏，治疗外伤，或煎服用于浮肿、腹痛等症。由于其适应性强，也是水土保持和改良天然草场的重要植物资源。同时，由于草木樨属种质分布范围广，在不同生境中形成了繁多的生态型，不同生境包括不同的经纬度和起源等要素，这些都构成了草木樨属种质的遗传多样性。此前，国内外学者主要通过形态学和细胞学特征对草木樨属种质进行鉴定，多偏重于对花色、种间杂种后代减数分裂行为的观察，以及不同种质核型染色体大小的比较分析，但是通过形态学特征往往不能准确区分各生态型，细胞学观察又太过费时费力。因此，建立一套快速、精确、廉价的草木樨属种质精准鉴定技术是非常必要的。

随着现代分子生物学的发展，分子标记越来越多的被应用于品种鉴定中，如以PCR反应为基础的SSR、miRNA-SSR、ILP、LTR-RT相关分子标记(RBIP、IRAP、ISBP、REMAP)等。LTR-RT序列在植物基因组中的广泛分布、可转移、较强的序列保守性都使其适合作为分子标记。与其它分子标记相比，LTR-RT相关标记具有基因组覆盖度广、灵敏度高、多态性丰富和插入突变稳定等优点，可广泛用于品种鉴定、系统发育分析、遗传多样性分析以及遗传连锁作图等方面；SSR标记具有较强的共显性、丰富性以及高信息含量，位于miRNA基因区域的SSR标记可以用作“功能遗传标记”，广泛用于标记辅助育种和基因组选择。

作为新型的分子标记，迄今为止，LTR-RT相关标记主要在蓝莓、樱桃以及大麦等少数植物中得到开发并主要应用于种质鉴定和遗传连锁图谱构建。如Yinghai Liang等利用LTR-RT相关标记研究了18份樱桃种质的遗传多样性(参见《Molecular Breeding》，2016年，《Development of retrotransposon-based molecular markers and their applicationin genetic mapping in chokecherry(Prunus virginianaL》)；miRNA-SSR分子标记主要在水稻、狗尾草以及芸苔属等少数植物中得到开发并主要应用于遗传多样性分析和种质鉴定。如Chandra Bhan Yadav等利用miRNA-SSR分子标记研究了18份小米种质的遗传多样性(参见Molecular Breeding》，2014年，《Development of novel microRNA-based geneticmarkers in foxtail millet for genotyping applications in related grassspecies》)。但在非模式植物草木樨中，LTR-RT以及miRNA-SSR相关标记的开发以及在品种鉴定中的应用尚未见报道。因此，在全基因组水平开发白花草木樨LTR-RT以及miRNA-SSR相关分子标记并研究其在草木樨属种质鉴定中的应用，对草木樨属种质鉴定以及分子标记辅助育种具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：