[发明专利]一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法和应用方法

权利要求书

1.一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述微生物改性剂的制备方法包括以下步骤：所述微生物改性剂由试剂A和试剂B所组成，所述试剂A为经微生物菌液所提取的胞内外脲酶溶液，所述试剂B为能够促使脲酶发挥水解作用的尿素溶液和钙源溶液。

2.根据权利要求1所述的一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述微生物菌液由巴氏芽孢杆菌进行活化培养之后再进行大量富集培养而得到，所述的巴氏芽孢杆菌为商品菌种，购自于美国菌种保藏中心，保藏编号：ATCC 11859。

3.根据权利要求2所述的一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述活化培养以及所述大量富集培养的要求为：液态培养基为NH₄-YE ，购自于美国菌种保藏中心，保藏编号：ATCC 1376；接种量5～6％，培养温度25～30 ℃，培养转速150～200rpm，培养时长36～48 h。

4.根据权利要求2所述的一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述胞内外脲酶溶液的提取步骤为：

（1）由高速温控离心机对所述微生物菌液进行离心沉降处理得到细菌液上清液和细菌菌落沉淀，所述细菌液上清液包含巴氏芽孢杆菌胞外脲酶，所述离心沉降处理的条件为:离心温度4 ℃、离心转速10000 rpm、离心时长20 min；

（2）每20ml所述微生物菌液经离心沉降处理得到的所述细菌菌落沉淀中，将所述细菌液上清液与溶菌酶溶解液按照5:3的体积比混合均匀并破胞，以获取巴氏芽孢杆菌胞内脲酶，所述破胞的条件为：破胞温度25℃、破胞时长1h；所述破胞完成后的所述破胞液再次由所述高速温控离心机在离心温度4 ℃、离心转速10000 rpm、离心时长20min下进行所述离心沉降处理获得破胞液，所述破胞液即为所述巴氏芽孢杆菌的所述胞内外脲酶溶液。

5.根据权利要4所述的一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述溶菌酶溶解液的配制方法包括以下步骤：

（1）准备溶菌酶冻干粉，所述溶菌酶冻干粉保存于-20℃环境下，使用时提前置于室温25℃下待用；

（2）准备无菌蒸馏水，在容器内将所述溶菌酶冻干粉与所述无菌蒸馏水按照1g ：10ml的比例进行搅拌混合，制备为每ml液体包含100mg溶菌酶的所述溶菌酶溶解液。

6.根据权利要求1所述的一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述试剂A在使用过程中应符合最低限度要求的单位酶活性值，所述最低限度要求的单位酶活性值采用电导率仪进行测定，测定方法为：将所述试剂A、2mol/L的尿素溶液、无菌蒸馏水按照体积比为1:5:4的比例进行混合搅拌，在25℃恒温水浴锅内进行反应，控制搅拌速度为250r/min；采用所述电导率仪测量并记录反应前5min内每分钟的电导率值变化，获得最终平均每分钟的电导率变化值K，单位为ms/min；根据公式U=10*K*A计算得出单位酶活性值U，单位为mmol·urea/min，其中，K为平均每分钟的电导率变化值，单位为ms/min； A为特定系数，取11.11；获得所述试剂A在使用过程中所述最低限度要求的单位酶活性值U为200mmol·urea/min。

7.根据权利要求1所述的一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述试剂B的成分包括尿素溶液和钙源溶液，所述钙源溶液为二水氯化钙溶液，所述尿素溶液与所述二水氯化钙溶液中的钙离子的摩尔比为1:1，所述尿素溶液的浓度为0.67 mol/L。

8.根据权利要求7所述的一种分散性土的绿色微生物改性剂的制备方法，其特征在于所述试剂B中的尿素浓度为40g/L、二水氯化钙浓度为98.5 g/L ，所述试剂B的初始PH值为6。