[发明专利]一种用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法

权利要求书

1.一种用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针，其特征是：以OTA为靶标，采用噬菌体表面随机展示十二肽库筛选出与OTA特异性结合的重组噬菌体，通过提取重组噬菌体的单链DNA进行测序及序列比对，获得了一条OTA特异性亲和配体序列，Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；后通过固相多肽合成与荧光标记获得与OTA特异性结合的荧光探针，FITC-Acp-Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；

所述荧光探针的制备方法是：

A、特异性亲和配体的筛选

(1)第一轮非特异性洗脱

a、将OTA用0.1mol/L、pH8.6的NaHCO₃溶液配制成80-100μg/mL的溶液,取1mL的该溶液于无菌的聚苯乙烯培养皿中进行包被，反复小心旋转直至培养皿表面完全湿润,完成后将培养皿放入铺有湿纱布的塑料盒中4℃孵育12小时以上；

b、孵育12小时以上倒掉培养皿中的包被液，并在经紫外照射过的滤纸上用力拍甩除去残留的包被液，除去残液后，向培养皿中加入2mL的封阻液，于3-5℃条件下封闭作用1hr以上；

c、封闭过后，按照b中所述的方法除去封阻液；然后用TBST缓冲液快速冲洗培养皿6次，每次都要小心旋转以使培养皿的底部及边缘均有被洗到，随后倒掉缓冲液，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的缓冲液，进行该操作时动作要快，以避免培养皿表面干燥；

d、用TBST缓冲液冲洗过后，往培养皿中加入1mL的TBST溶液，再加入2×10¹¹的噬菌体，于室温条件下温和摇动1hr；

e、充分反应后，倒出未结合的噬菌体，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的液体；

f、按照c中所述的方法用TBST缓冲液冲洗培养皿10次，每次冲洗后拍甩残留的TBST缓冲液时都要换滤纸，以防止交叉污染；

g、冲洗完后向培养皿中加入1mL的非特异性缓冲液，即0.2mol/L的Glycine-HCl酸碱度为pH 2.2、并含有1mg/mL BSA，用来洗脱可与OTA特异性结合的噬菌体，于室温条件下温和摇动1hr，反应过后将培养皿中的洗脱液吸出，放入已灭菌的微量离心管中，然后向其中加入150μL的1mol/L的Tris-HCl酸碱度为pH 9.1溶液中和上述洗脱液，中和后的溶液即为第一轮非特异性洗脱物；

(2)第一轮洗脱物滴度测定

a、接大肠杆菌ER2738单菌落于10mL已灭菌的LB液体培养基中，于全温振荡培养箱中37℃、175rpm的条件下培养，培养至对数生长期为OD₆₀₀＝0.5；

b、将第一轮洗脱物用已灭菌LB液体培养基在超净工作台内进行10倍系列梯度稀释，同时在37℃生化培养箱中温育LB/IPTG/X-gal平板，每个噬菌体稀释度要准备一个平板备用；

c、将顶层琼脂放置于微波炉中融化，然后在超净工作台内分成3mL等份置于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度需要一份，分装完后放置在45℃干燥箱中保温备用；

d、当ER2738菌液培养到对数生长期时取出，分成200μL等份存于已灭菌的微量离心管中，每个噬菌体稀释度准备一管ER2738培养物；然后分别向每管ER2738培养物中加入10μL不同稀释度的噬菌体，快速颠倒混匀，于室温条件下温育3-5min；

e、将感染噬菌体的ER2738培养物分别加入到43-45℃条件下保温的顶层琼脂中，一次添加一管，快速颠倒混匀，注意不要摇出气泡，然后立即倾注于已在37℃生化培养箱中预温过的LB/IPTG/X-gal平板上，在琼脂凝固前适当倾斜或轻轻摇晃平板使顶层琼脂均匀铺开，待平板冷却5min后，倒置于37℃生化培养箱中培养12小时以上；

f、检查平板，挑选有30-100个噬菌斑的平板并计算平板上的噬菌斑数；然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位滴度；

g、确定滴度后，计算第一轮洗脱物中噬菌体的量和第一轮非特异性筛选的回收率；

(3)第一轮洗脱物扩增

a、接ER2738单菌落于已灭菌的LB-Tet液体培养基中，然后放置在全温振荡培养箱中37℃，175rpm条件下培养12小时以上；后将ER2738培养物以1:100的比例稀释于20mL的LB液体培养基中，向锥形瓶中加入第一轮洗脱物，混匀后，于全温振荡培养箱中37℃剧烈摇动培养4-6hr；

b、将培养后的ER2738培养物转移至已灭菌的离心管中，于4℃、10000rpm的条件下离心10min，然后将上清液转入另一已灭菌的离心管中，同样条件重复离心一次，将上清液上部的80％溶液转入一新的已灭菌的离心管中，后加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃条件下沉淀12小时以上；

c、取沉淀过夜的溶液于4℃、10000rpm的条件下离心15min，弃去上清液，再短暂离心，然后用微量移液枪吸去残留的上清液；

d、向沉淀物中加入1mL的TBS溶液，使沉淀物重悬，然后将重悬液转移至已灭菌的微量离心管中，4℃条件下离心5min使溶液中残余的细胞沉淀下来，将上清液转移至新的已灭菌的微量离心管中，然后用1/6体积的PEG/NaCl溶液再沉淀，于冰上孵育1hr；

e、冰浴过后，于4℃、10000rpm的条件下离心10min，弃去上清，再短暂离心，用微量移液枪吸去残留的上清液，后将沉淀物重悬于200μL TBS含0.02％NaN₃溶液中，离心1min，沉淀溶液中任何残余的不溶物，将上清转移至新的已灭菌的微量离心管中，此即为扩增后的洗脱物，记为一扩洗脱物；

(4)一扩洗脱物的滴度测定

根据(2)中所述的方法对一扩洗脱物进行滴度测定，然后计算一扩洗脱物中噬菌体的量，并换算出相应于2×10¹¹pfu的第二轮筛选中噬菌体的加入量，若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定；

(5)第二轮非特异性洗脱

根据(1)中的步骤a-c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用一扩洗脱物中相当于2×10¹¹pfu的噬菌体的量重复步骤d-g；另外，在清洗步骤中使用的TBST缓冲溶液中的Tween-20的浓度要增至0.5％，将最后得到的洗脱液记为第二轮洗脱物；

(6)第二轮洗脱物的滴度测定

根据(2)中所述方法对第二轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第二轮洗脱物中噬菌体的量和第二轮非特异性筛选的回收率；

(7)第二轮洗脱物的扩增

根据(3)中所述方法对第二轮洗脱物进行扩增，扩增后的洗脱物记为二扩洗脱物；

(8)二扩洗脱物滴度测定

根据(2)中所述方法对二扩洗脱物进行滴度测定，然后计算二扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×10¹¹pfu的第三轮筛选中噬菌体的加入量，若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定；

(9)第三轮特异性洗脱

根据(1)中的步骤a-c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用二扩洗脱物中相当于2×10¹¹pfu的噬菌体的量重复步骤d-f，步骤g中的洗脱液用1mL 10μg/mL的OTA单克隆抗体配制的溶液替换，代替非特异性洗脱液进行特异性洗脱，本次收集到的洗脱液不需要用Tris-HCl中和，即为第三轮洗脱物，清洗步骤中TBST缓冲溶液中的Tween-20的含量同样为0.5％；

(10)第三轮洗脱物滴度测定

根据(2)中所述方法对第三轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第三轮洗脱物中噬菌体的量和第三轮特异性筛选的回收率，同时将有30-100个噬菌斑的滴度测定平板于4℃冰箱存放留用；B、重组噬菌体DNA的提取及目标序列的确定

从4℃冰箱中保存的第三轮洗脱物滴度测定平板中随机挑选40个蓝斑分别进行扩增，然后对这些噬菌体进行ssDNA提取，实验步骤如下；

(1)取扩增后的噬菌体溶液各200μL至已灭菌的微量离心管中，分别加入等体积量的Tris饱和酚，随后将微量离心管温和振荡2min，振荡完后，于4℃、12000rpm条件下离心5min；

(2)离心后将上层水相转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入100μL的Tris饱和酚和100μL的氯仿-异戊醇溶液，它们体积比为24:1，随后将微量离心管温和振荡2min，振荡完后，于4℃、12000rpm的条件下离心5min；

(3)离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入200μL的氯仿-异戊醇溶液，它们体积比为24:1，随后将微量离心管温和振荡2min，然后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min；

(4)离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中并记下体积，同时加入1/8体积的NaAc酸碱度为pH 4.6和500μL的-20℃冷乙醇，然后在-20℃的条件下沉淀1hr；

(5)取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心5min，用微量移液枪吸去上清液，向沉淀中加入500μL的70％-20℃冷乙醇，在-20℃的条件下重沉淀1hr；

(6)取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心20min，用微量移液枪迅速吸除上清液，将微量离心管放置在室温条件下等待乙醇挥发干净，然后往微量离心管中加入10μL的TE溶液使沉淀复溶，此即为噬菌体的ssDNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送样测序；

(7)通过观察比对测得的所有序列，最终获得了一条分子量为1599.95的OTA特异性亲和配体肽序列，即为，Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；

C、OTA荧光探针的制备

(1)将取代度为1.03mmoL/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂用DCM溶液浸泡0.5hr使其溶胀；

(2)使用沙芯对溶剂进行抽滤，添加3倍摩尔过量的Fmoc-His(Trt)-OH氨基酸，加入DMF溶液进行溶解，然后添加10倍摩尔过量的DIEA，充分震荡1hr；采用DMF和DCM交替淋洗6次，而后用甲醇进行封闭；

(3)将DMF丢弃，添加20％哌啶DMF溶液，振荡5min，去除DMF，再添加该溶液，充分振荡15min；

(4)抽掉20％哌啶DFM溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入配置好的检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；

(5)依次使用10mL/g的DMF洗两次，10mL/g的DCM洗两次，10mL/g的DMF洗两次；

(6)将保护氨基酸3倍过量，HBTU 3倍过量均用尽量少的DMF溶解，加入到反应管中，立刻加入DIEA 10倍过量.反应30min；

(7)取十数粒树脂，用乙醇洗三次，加入配置好的检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应；

(8)依次使用10mL/g的DMF洗一次，10mL/g的DCM洗两次，10mL/g的DMF洗两次；

(9)重复(3)-(6)操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；连接6-Acp，最后接5-FITC，避光反应4h，后续所有步骤全部避光处理；

标记FITC操作方法，在避光的条件下，将合成氨基酸肽链的N端与6-氨基己酸的C端相连，N端连接FITC荧光素，即完成了FITC的标记；

(10)依次使用10mL/g的DMF洗两次，10mL/g的甲醇洗两次，10mL/g的DMF洗两次，10mL/g的DCM洗两次，真空抽干10min，干燥12小时以上；

(11)从树脂上切割多肽，将配置好的切割液加入到反应管中，切割时间为120min；

(12)将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干，即可获得FITC标记的OTA荧光探针粗品，-20℃避光贮存；

(13)荧光探针粗品经HPLC分离、纯化，HPLC条件为，

柱温，35℃；检测波长，220nm；流动相A，含有0.1％TFA的水溶液；流动相B，含有0.1％的乙腈溶液；梯度洗脱，25％乙腈～45％流动相B溶液；

(14)收集目的多肽溶液放入冻干机中浓缩，冻干呈白色粉末，-20℃避光保存；

(15)荧光探针纯品通过质谱仪测定分子量为2102.53，与理论分子量相符，获得配体肽荧光探针序列为FITC-Acp-Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；

D、建立荧光探针标准检测曲线

(1)用前述NaHCO₃溶液将OTA标准品分别配制成0.4ng/mL，0.8ng/mL，1.6ng/mL，3.2ng/mL，4ng/mL，8ng/mL，10ng/mL的溶液，然后取不同浓度的OTA溶液各200μL分别包被96孔板，同时用NaHCO₃溶液包被三个孔，每孔添加200μL作为阴性对照，包被1hr；

(2)除去包被液，向包被孔中加满封阻液，阴性对照孔也要进行封闭，在4℃条件下封闭1hr；

(3)除去封阻液，然后用TBST溶液洗板6次，每次倒完溶液后均要在干净的滤纸上拍净残留在包被孔中的溶液，此步骤动作要快避免包被孔干燥影响结果；

(4)向包被孔中各加入200μL荧光探针溶液，阴性对照孔也不例外，于室温条件下避光振荡10min；

(5)后除去各孔中未结合的荧光探针溶液，用TBST溶液洗板6次，如步骤(3)中所述；

(6)向各孔中分别加入200μL的TBST溶液，然后利用多功能微孔检测仪在528nm条件下测定荧光吸收值，建立标准检测曲线。