[发明专利]一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法

权利要求书

1.一种包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述包膜替换型病毒载体疫苗是将弹状病毒基因组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因截短体或病毒刺突蛋白S基因的胞外段融合体ECD-CA，利用反向遗传系统构建得到的用于预防冠状病毒感染的包膜替换型病毒载体疫苗，所述ECD-CA定义为病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD融合VSV病毒囊膜蛋白GP的跨膜和胞内段后的基因。

2.根据权利要求1所述包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因选自SARS或SARS-CoV-2冠状病毒，所述刺突蛋白S基因截短体选自C端氨基酸缺失对应的基因，所述C端氨基酸缺失个数为18～72个。

3.根据权利要求2所述包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述刺突蛋白S基因截短体选自C端缺失的基因，所述C端氨基酸缺失数目优选30个，且对应修饰后的刺突蛋白S对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

4.根据权利要求1所述包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因的胞外段融合体ECD-CA选自冠状病毒，所述ECD-CA包含冠状病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD，所述ECD的C端融合了VSV的囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因CA。

5.根据权利要求4所述的包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述ECD-CA克隆到VSV基因组中M基因和L基因之间的编码阅读框中，所述ECD-CA氨基酸序列为SEQ ID NO.2,所述ECD-CA人源化密码子基因序列为SEQ ID NO.3。

6.根据权利要求2所述冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述水泡性口炎病毒是其基质蛋白M的氨基酸发生突变后得到的病毒，所述基质蛋白M中氨基酸突变位点为第20位的亮氨酸、第51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸中的一个或多个且为非同义突变。

7.根据权利要求4所述冠状病毒包膜替换型病毒载体，其特征在于：所述病毒载体是减毒水泡性口炎病毒，所述水泡性口炎病毒的基质蛋白M发生3位点氨基酸的突变，所述基质蛋白M的第20位由亮氨酸L突变为苯丙氨酸F、第51位由甲硫氨酸M突变为丙氨酸A、第110位由苯丙氨酸F突变为亮氨酸L，所述的3位点突变的基质蛋白M氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

8.一种包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，包括如下步骤：

S1、利用合成生物学得到如权利要求2,3或6中任一所述冠状病毒的S-CN截短体基因或如权利要求1,4,5或7任一所述ECD-CA包膜基因，基因片段用MluI和XhoI双酶切克隆至pVSV-3M质粒多克隆位点中，分别得到pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA质粒，其中所述冠状病毒的S-CN定位为冠状病毒刺突蛋白S基因在C端缺失N个氨基酸后对应的基因序列缩写，所述其中N＝18～72中的任一自然数；

S2、用表达T7-RNA聚合酶的质粒pCAGGS-T7瞬转293T-ACE2细胞；24h后将内毒素去除的质粒包括pCAGGS-P、pCAGGS-N、pCAGGS-L及pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA的质粒制备转染混合液；

S3、对四质粒进行脂质体包裹共转染72h后，将上清液通过0.22um的滤膜过滤后加入到对数生长期的ACE2稳定表达的细胞中；

S4、细胞出现病变，则收集细胞上清液，利用RT-PCR技术进行病毒基因组中包膜替换目的基因拷贝数的鉴定；

S5、用ACE2稳定表达的细胞进行空斑纯化，经蛋白免疫印迹鉴定后得所述可复制性的冠状病毒包膜替换型疫苗VSV-△G-S-CN或VSV-△

G-ECD-CA。