[发明专利]抑制ACSL1基因表达的siRNA及其应用

说明书

本发明提供抑制ACSL1基因表达的siRNA，还提供该siRNA在制备提高牛不饱和脂肪酸含量和降低牛脂滴含量的药物中的应用。本发明将针对ACSL1基因序列设计合成的3条siRNA转染到牛脂肪细胞中，脂肪细胞生长状态良好，经RT‑qPCR及Western Blot方法检测，可以有效抑制牛脂肪细胞中ACSL1基因mRNA水平及蛋白水平的表达，其中siRNA3‑ACSL1抑制效率最高。试验周期短、操作简单、效率高，具有较强的实用性。本发明所提供的siRNA可用于与ACSL1基因相关的功能研究，如牛脂肪细胞中不饱和脂肪酸合成的调控作用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及抑制ACSL1基因表达的siRNA及其应用。

背景技术

机体内脂肪酸的含量和组成不仅是衡量牛肉品质的重要因素，也是评价肉制品是否有益于人体健康的重要标志。据报道，血液中脂肪酸的饱和度能够通过影响胆固醇水平导致肥胖和心血管疾病的产生。肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)是牛肉中脂肪沉积的主要形式之一，而IMF中富含棕榈酸和硬脂酸，人体中摄入这两种酸能够有效预防冠心病。同时，牛肉中富含对人体有益的n-3FA。病理研究发现，n-3FA能够抑制淋巴细胞增殖，降低癌症发病率，而n-6FA会促进癌症发生。因此，n-6/n-3的比值能够间接反映人体健康程度。此外，牛肉中含有的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)对心血管疾病预防、减少动脉粥样硬化及胎儿大脑及视觉的发育等方面有积极作用，因此，研究牛肉中不饱和脂肪酸合成的调控机制，进一步提高牛肉中“健康”脂肪酸的含量和降低“有害”脂肪酸的含量对未来牛肉品质的改善至关重要。

长链脂酰辅酶A合成酶1(long-chain acyl-CoA synthetase 1,ACSL1)激活的酰基辅酶A可以参与任何代谢，包括脂肪生物合成和脂肪酸降解。ACSL1基因能够通过促进脂肪酸的摄入而增加体内不饱和脂肪酸的沉积，它可以将部分饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸运送到细胞内并进行催化，形成的脂酰辅酶A可以作为硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoAdesaturase,SCD)的底物而被用于单不饱和脂肪酸的合成，也可与FABP3结合后进入内质网用于甘油三酯的从头合成。用油酸短期孵育3T3-L1脂肪细胞、HepG2细胞后发现，超表达ACSL1基因可以促进油酸的摄入，提高甘油三酯中油酸的沉积，从而增加不饱和脂肪酸在细胞内的沉积量。另外，研究发现滋养层细胞对于DHA和AA的摄入量主要取决于ACSL1基因的活性，当ACSL1基因表达量减少时，DHA和AA的摄入量也随之减少。QTL分析认为ACSL1作为最重要的位置和功能上的候选基因，直接影响牛肉骨骼肌中多不饱和脂肪酸的组成，ACSL1基因多态性与牛肉骨骼中肌中不饱和脂肪酸组分(n-3脂肪酸、多不饱和脂肪酸、n-3长链多不饱和脂肪酸、反式油酸)的相对含量以及比例呈极显著相关。前期研究发现，腺病毒E2转录结合因子-1(,E2 transcription factor-1,E2F1)、特异性蛋白1(,specificity protein1,SP1)、肾脏富集Kruppel样因子(kruppel-like factor 15,KLF15)和和腺病毒E2转录结合因子-4(,E2 transcription factor-4,E2F4)位于ACSL1基因核心启动子区域CpG岛上，协同调控ACSL1基因表达，并且与脂肪细胞中不饱和脂肪酸合成密切相关，揭示ACSL1可能是调控牛肌内脂肪细胞中不饱和脂肪酸合成的关键基因。而且已有研究表明ACSL1基因对细胞内的不饱和脂肪酸以及饱和脂肪酸均有代谢作用(Golej et al.,2011)。

随着基因组学时代的到来，基因功能研究的重要性日益突出，除了传统的基因过量表达外，靶向沉默和完全敲除基因的表达也成为目前研究基因生物学功能的重要手段。因此，近年来RNA干扰技术的发展得到飞速发展。RNA干扰技术的作用原理主要包含siRNA的形成、靶mRNA的降解和RNAi的产生三部分。首先用Dicer酶将双链的RNA剪切为siRNA；然后在解旋酶的作用下形成能够指导RNA诱导的沉默复合体，该复合体通过碱基互补配对将同源序列的靶mRNA剪切而降解靶mRNA；最后在RNA聚合酶的作用下合成新的双链RNA。通过多次循环最终产生高效的基因沉默效应。