[发明专利]一种检测NDM-1耐药蛋白双抗夹心ELISA试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种用于检测细菌中NDM‑1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，包括包被有单克隆抗体8E3的酶标板、检测抗体4G7‑HRP、NDM‑1蛋白标准品。本发明选用8E3作为捕获抗体，4G7‑HRP作为检测抗体研制了NDM‑1双抗夹心ELISA检测试剂盒，并对其进行了方法学系统评估，结果显示试剂盒特异性好，灵敏度高，为NDM‑1阳性耐药菌的快速检测提供了一种技术手段。

技术领域

本发明涉及一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于免疫学分析技术领域。

背景技术

近年来，由于抗生素在临床大量使用甚至不当使用，在抗生素的选择压力下，临床疾病相关细菌的耐药菌株不断出现，而且出现多重耐药株，由于耐药菌可进行多途径高速率传播，尤其是人畜的交叉感染，严重威胁了人类的生命安全，同时大大增加了临床抗感染的难度。

NDM-1又名“新德里金属-β-内酰胺酶1”，简称为NDM-1。新德里金属β内酰胺酶-1(NDM-1)属于B1亚类金属β内酰胺酶，能水解除氨曲南外的绝大多数β内酰胺类抗菌药物，其基因大多定位在质粒上，易引起水平传播。2010年Kumarasamy等报道了产NDM-1肠杆菌在印度、巴基斯坦以及英国等国家的流行，引起国际性的关注。随后，美国、德国、日本、中国香港等地不断检出携带NDM-1的菌株，多为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌等临床常见的致病菌。据报道，这种病可以通过饮水等途径传染，表现症状为肠道感染，这种新型细菌对几乎所有抗生素都具有抗药性，死亡率很高，不仅在医院中存在，在自然界中也同样存在。

目前现有检测NDM-1的方法主要有纸片扩散法、Etest检测法、微量稀释法、PCR等。其中，纸片扩散法缺乏特异性，仅适合初筛试验，Etest检测法、微量稀释法灵敏度低，而PCR可通过特异性引物对NDM-1阳性细菌进行确证，但对仪器设备的要求较高，且操作复杂，不易在临床应用，而ELISA作为常用的检测微生物的方法，具有快速、灵敏、高通量、特异性好等特点，因此建立一种用于检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA试剂盒及方法具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速的检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体8E3的酶标板、检测抗体4G7-HRP、NDM-1蛋白。

在一个实施方案中，所述检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：

1）重组NDM-1(36-270)蛋白为通过截断NDM-1序列，N端添加HIS标签，克隆至表达载体pET-28a，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的；

上述重组NDM-1（36-270）蛋白氨基酸序列为序列1；

在一个实施方案中，所述NDM-1单克隆抗体8E3，4G7为采用重组NDM-1（36-270）蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的；

所述单克隆抗体8E3的重链可变区的氨基酸序列为序列2；

所述单克隆抗体8E3的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；

所述单克隆抗体4G7的重链可变区的氨基酸序列为序列4；

所述单克隆抗体4G7的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。

在一个实施方案中，所述检测抗体4G7-HRP的制备方法包括如下步骤：