[发明专利]MCR-1耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种用于检测细菌中MCR‑1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，包括包被有单克隆抗体4E5的酶标板、检测抗体5B3‑HRP、MCR‑1蛋白标准品。本发明选用4E5作为捕获抗体，5B3‑HRP作为检测抗体研制了MCR‑1双抗夹心ELISA检测试剂盒，并对其进行了方法学系统评估，结果显示试剂盒特异性好，灵敏度高，为MCR‑1阳性耐药菌的快速检测提供了一种技术手段。

技术领域

本发明涉及一种用于检测MCR-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及方法，属于免疫学分析技术领域。

背景技术

近年来，由于多重耐药菌株的出现，粘菌素在人类医学中被重新引入，以治疗与健康相关的感染，从而导致大肠埃希菌和沙门菌对黏菌素的耐药日趋严重。2015年，华南农业大学药理课题组于上海一猪场首次发现一株质粒介导的可转移耐药基因MCR-1，且报道在人和动物和食物中均检测出质粒介导的粘菌素耐药基因MCR-1，并证实该基因可通过接合型质粒在不同菌属间传播，且速度快。这与之前大家所认知的染色体介导粘菌素耐药所不同，从分子机制上解释了目前国内外多粘菌素耐药性迅速升高的原因。MCR-1基因的发现，预示着抗生素的最后一道防线---多粘菌素已然遭到威胁，同时对动物和人类的健康也造成了严重的威胁。

目前，现有的耐药基因检测方法中，一般通过传统的微生物培养法、药敏试验法、聚合酶链反应（PCR）技术、基因芯片技术等方法来判定微生物是否对某一种抗生素具有耐药性，但前两种方法费时且操作复杂，不能满足现场检测的需求。而后两种检测方法操作繁琐，需要专业仪器且昂贵等缺点，不适合临床大规模推广应用。本发明应用的酶联免疫吸附法（ELISA）具有快速、灵敏、特异性好且操作简便等特点，因此建立一种用于检测MCR-1基因的双抗夹心ELISA检测试剂盒及方法，对其基因检测和方法开发具有重要意义。

发明内容

在本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速的检测MCR-1耐药蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测细菌中MCR-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体4E5的酶标板、检测抗体5B3-HRP、MCR-1蛋白标准品。

在一个实施方案中，所述检测MCR-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：

PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到MCR-1重组蛋白；

上述重组MCR-1蛋白氨基酸序列为序列1。

在一个实施方案中，所述MCR-1单克隆抗体4E5，5B3为采用重组MCR-1蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的；

所述单克隆抗体4E5的重链可变区的氨基酸序列为序列2；

所述单克隆抗体4E5的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；

所述单克隆抗体5B3的重链可变区的氨基酸序列为序列4；

所述单克隆抗体5B3的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。

在一个实施方案中，所述检测抗体5B3-HRP的制备方法包括如下步骤：

（1）称取5 mg HRP溶于1mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.20 mL新配的0.1 M NaIO₄溶液，4℃避光搅拌25 min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，用1 M，pH 4.4的醋酸钠缓冲液中4℃过夜透析，然后10000 r/min，4℃，离心10 min，去除沉淀；得到透析后的HRP；