[发明专利]一种检测多杀性巴氏杆菌病的RAA引物、探针及检测方法

说明书

本发明公开了一种RAA荧光法检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出多杀性巴氏杆菌质粒和阳性样本，与支原体、链球菌、大肠杆菌、附红细胞体、新孢子虫、弓形虫、健康牛血液无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法快速检测多杀性巴氏杆菌DNA的方法，灵敏度高，每反应检测灵敏度达到10copies/μL。

技术领域

本发明属于细菌分子生物学检测技术领域，具体涉及一种RAA荧光法检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及检测方法。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)最早于1881年在患有禽霍乱的病鸡中分离发现，属巴氏杆菌科巴氏杆菌属，可感染多种家畜、家禽、野生动物及人，是一种人兽共患病。机体感染Pm后常出现急性、出血性或败血性症状，如禽霍乱、牛出血性败血症、猪肺疫等病。Pm是两端钝圆，呈球杆状或短杆状的革兰氏阴性菌，是兼性厌氧菌，用吉姆萨或美兰染色，呈两极浓染，且有荚膜。Pm的抗原特性可根据荚膜血清分组，分为A、B、D、E、F等5种血清群，我国畜禽多流行A、B、D血清型，其中B型是引发牛出血性败血症的主要血清型。人可通过被携带Pm的猫、狗咬伤而感染。机体感染Pm后，常出现体温升高，呼吸困难，末期出现败血症、躺卧不起直至死亡。该病潜伏期短，通常为1-3天，在病程的早期(发热阶段)如不及时准确的采取措施，病死率可达100％。该病的发生与流行直接危害畜牧业健康发展、畜产品安全和公共卫生安全，临床上快速诊断该病主要以镜检为主，缺乏敏感性和特异性，因此建立一种敏感特异，能快速诊断该病的检测方法十分必要。

临床上对多杀性巴氏杆菌的快速诊断多采用样品涂片染色镜检，但因镜检方法人为主观因素大，且敏感性、特异性低，常出现误判和漏检等现象。为提高检测的灵敏性和准确性，细菌分离鉴定、环介导等温扩增技术(LAMP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法被用于Pm的实验室检测，但这些方法都存在敏感性弱、特异性差和检测耗时常等缺点。荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术在检测Pm上的应用大大提高了检测的敏感度和特异性，但该方法需要反复的升降温，需要复杂的仪器和较高的检测环境，耗时时间长，对操作人员有一定的技术要求，不适合临床现场快速检测。因此，建立一种特异敏感且适合临床快速诊断的检测方法，快速准确的诊断该病，及时阻断传播，对该病的预防控制具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种RAA荧光法检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及检测方法，可实现在39℃条件下20min内完成多杀性巴氏杆菌的检测，具有快速、特异、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测的特点。

本发明首先提供一种检测多杀性巴氏杆菌病的RAA荧光法扩增用的引物，包含有：

上游引物：5’-TATTTTGGCGTGATGAATCAAGCGGTCACAG-3’(SEQ ID NO：2)；

下游引物：5’-AATAAAAGACTACCGACAAGCCCACTCACAACGAG-3’(SEQ ID NO：5)；

本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，所述探针序列如下：

5’-TGATTAATATTGTGCTGACATTACTGCTCTATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’(SEQ ID NO：6)；

所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5′端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3′端碱基数19bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基A，其中A用四氢呋喃残基替换；

修饰后的探针为：

5’-TGATTAATATTGTGCTGACATTACTGCTC/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/CCGCTATTTACCCAGTGG-3’。