[发明专利]一种增强微生物固氮能力的人工非编码RNA模块

说明书

本发明涉及利用合成生物学方法创建的人工非编码RNA模块及其在人工固氮体系构建中的用途。所述RNA模块通过与固氮酶编码基因nifHDK mRNA的相互作用，增强nifHDK mRNA转录后的稳定性，进而提高了底盘微生物的固氮能力。本发明构建了人工RNA模块的融合表达载体，并转入到不同的底盘固氮微生物中。实验证实，在固氮条件下，本发明的人工RNA模块能够显著提高重组工程菌株固氮酶活性。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增强微生物固氮能力的人工非编码RNA模块及其在固氮合成生物学中的应用。

背景技术：

生物固氮是固氮微生物特有的一种生理功能，这种功能是在固氮酶的催化作用下进行的，受胞内能源供应和环境胁迫因子影响较大。为适应环境变化，固氮微生物在进化过程中形成了一套复杂的调控系统，固氮细胞需要表达和维持足够的固氮基因(nif)mRNAs分子，才能确保高效固氮酶活。

天然固氮体系由于受环境影响较大，导致固氮效率低下，从而极大地限制了其在农业生产中的应用。因此利用合成生物学方法，人工设计标准化、智能化的信号响应元件及功能模块，构建高效固氮基因回路，在微生物底盘中进行适配机制研究，创制新型人工固氮体系，是提高生物固氮效率，实现其在农业广泛应用的新策略和新途径。

非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)是一类非常重要的转录后调节子。其通过与mRNA碱基配对，在转录后水平抑制或是激活靶基因的表达，进而在细菌不同的代谢调控过程中发挥重要的调节作用。在固氮菌中也发现了多个ncRNAs可能参与固氮基因的表达调控，其中非编码RNA NfiR和NfiS分别通过与固氮酶基因nifD和nifK mRNA的相互作用协同参与固氮酶活的调控。

因此，人工设计ncRNAs，利用其参与固氮酶调控的作用特性可以构建人工高效固氮体系。

发明内容：

本发明的目的是设计与合成一种人工非编码RNA模块，用于各种人工高效固氮体系构建。

本发明提供了一种人工非编码RNA模块(Artificial Nitrogenase activity-Enhancing non-coding RNA)，命名为AneR，由以下元件构成：

(1)含有与固氮酶编码基因nifHDK mRNA互补配对区的人工RNA编码序列，其核苷酸序列由SEQ ID NO:2所示

(3)启动所述人工RNA编码基因转录的σ⁵⁴依赖型人工启动子元件，其核苷酸序列由SEQ ID NO:3所示。

本发明的人工非编码RNA模块AneR提高底盘微生物的固氮能力的原理是：AneR通过与固氮酶编码基因nifHDK mRNA的相互作用，增强nifHDK mRNA转录后的稳定性。

本发明构建了该人工RNA模块的表达载体pAneR，其表达受固氮条件诱导表达的人工启动子控制，将该融合载体分别转至固氮施氏假单胞菌、肺炎克氏杆菌及棕色固氮菌3株固氮微生物底盘中，获得了3个具有新型人工固氮回路的重组工程菌株。

实验证实，在固氮条件下，本发明的人工RNA模块AneR能够显著提高多种重组工程菌株固氮酶活性。

本发明是通过以下具体工作得到上述人工RNA功能元件模块，并证实其功能：

1、人工RNA模块AneR的设计与合成