[发明专利]SDK2基因突变小鼠模型构建方法及其应用

权利要求书

1.一种SDK2基因突变小鼠模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步：从SDK2基因中选择待突变的靶位点，所述靶位点为R87C；基于CRISPR/Cas9系统，设计构建能够特异性识别SDK2基因的sgRNA，所述sgRNA包括一条5’Guide和一条3’Guide，所述5’Guide的碱基序列如SEQ ID No.1～7中任一项所示，所述3’Guide的碱基序列如SEQ ID No.8～14中任一项所示；

第二步：以所述sgRNA为基础设计引物，并构建载有所述引物的打靶载体，所述引物的碱基序列如SEQ ID No.47～54所示：

第三步：将所述sgRNA和所述打靶载体注入小鼠受精卵中，将所述受精卵移植到代孕小鼠体内，产出小鼠并进行基因型鉴定，选出SDK2基因突变的F0代小鼠与野生型小鼠杂交，得到SDK2基因突变的F1代小鼠，即为所述SDK2基因突变小鼠模型。

2.如权利要求1所述的SDK2基因突变小鼠模型构建方法，其特征在于，第一步的具体方法如下：利用Cas9 mRNA检测所有sgRNA的活性，从中筛选出活性最强的sgRNA，如SEQ IDNo.6和SEQ ID No.8所示。

3.如权利要求1所述的SDK2基因突变小鼠模型构建方法，其特征在于，第二步的具体方法如下：

(1)以所述sgRNA为基础设计引物，如SEQ ID No.47～54所示，包括LR、A、RR三组引物；

(2)将所述引物的PCR产物按照LR、A、RR的顺序依次连接到pBlunt载体上、构建打靶载体。

4.如权利要求1所述的SDK2基因突变小鼠模型构建方法，其特征在于，第三步的具体方法如下：

(1)对所述sgRNA进行体外转录；

(2)将转录产物和所述打靶载体注入小鼠受精卵中，将所述受精卵移植到代孕小鼠体内，产出小鼠并进行基因型鉴定；

(3)选出SDK2基因突变的F0代小鼠与野生型小鼠杂交，得到SDK2基因突变的F1代小鼠，即为所述SDK2基因突变小鼠动物模型。

5.如权利要求4所述的SDK2基因突变小鼠模型构建方法，其特征在于，第三步中，对F0代幼鼠进行基因分型使用的引物的碱基序列如SEQ ID No.63～66所示。

6.一种用于构建权利要求1～5中任一项所述的SDK2基因突变小鼠模型的试剂盒，其特征在于，包括能够特异性识别SDK2基因并且造成R87C表达突变的sgRNA，以及以所述sgRNA为基础设计的、用于连接到打靶载体上的引物，所述sgRNA包括一条5’Guide和一条3’Guide，所述5’Guide的碱基序列如SEQ ID No.1～7中任一项所示，所述3’Guide的碱基序列如SEQ ID No.8～14中任一项所示；所述引物的碱基序列如SEQ ID No.47～54所示。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于对F0代幼鼠进行基因分型使用的引物，所述引物的碱基序列如SEQ ID No.63～66所示。

8.权利要求1～5中任一项所述的方法在构建遗传性先天性白内障小鼠模型中的应用。

9.权利要求1～5中任一项所述的方法构建的SDK2基因突变小鼠模型在筛选治疗白内障的药物中的应用。

10.权利要求1～5中任一项所述的方法构建的SDK2基因突变小鼠模型在研究白内障致病机理的应用。