[发明专利]一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法及应用

权利要求书

1.一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，该制备方法按以下步骤进行：

一、将鹿茸中血液去除干净，然后去除外皮；

二、将步骤一处理后的鹿茸浸泡于含抑肽酶的PBS缓冲液中，然后置于密闭加压装置中，于压力为80MPa～120MPa，温度为25～35℃下保压10min～15min；

三、将步骤二处理后的鹿茸切成薄片，然后研磨至粒径为0.07mm～0.16mm，得到鹿茸骨泥；

四、①按料液比1：(1～2)将鹿茸骨泥和冻融缓冲液置于金属密闭容器中，于3～5℃下孵育2h～4h，然后用液氮急冻30min～75min，再在35～40℃水浴中解冻15min～45min，去除上清液后重复操作2～3次；所述冻融缓冲液由Tris-HCl和Triton X混合而成，pH为8，其中Tris-HCl的浓度为10mM，Triton X的质量浓度为1.5％～2％；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h；

五、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入胰蛋白酶消化液，于35～40℃下振荡孵育，每隔2h～4h更换一次胰蛋白酶消化液，共孵育24h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；所述胰蛋白酶消化液的pH为8.6，胰蛋白酶的质量浓度0.25％～0.5％；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h；

六、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入EDTA去污剂，于3～5℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；所述EDTA去污剂的pH为7.0～7.2，EDTA浓度为0.1mol/L～0.5mol/L；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h，重复2～3次；

七、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入核酸清除剂，于35～40℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作3～5次；所述核酸清除剂为含DNAse和RNAse的Tris-HCl缓冲液，其中DNAse的含量为50U/mL～80U/mL，RNAse的含量为2.5U/mL～5U/mL，Tris-HCl的浓度为50mM；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h，重复2～3次；

八、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入除菌剂，于3～5℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；所述除菌剂为含过氧乙酸的PBS缓冲液，pH为7.2，其中过氧乙酸的质量浓度为0.1％～0.3％；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入无菌去离子水，于3～5℃下振荡12h～24h，重复3～5次；

九、去除上清液后真空冷冻干燥，得到基质冻干粉；

十、按基质冻干粉的质量与胃蛋白酶消化液的体积的比为1：(5～10)将二者混合，于35～40℃下振荡消化36h～72h，离心后取上清液于3～5℃下预冷处理2h～4h，然后用冰NaOH溶液调整pH至7.2～7.4，得到温敏型鹿茸软骨基质水凝胶；所述胃蛋白酶消化液的pH为2.8～3，其中胃蛋白酶的浓度为1mg/mL，盐酸的浓度为0.5M。

2.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤三中所述薄片厚度为4mm～6mm。

3.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤九中所述真空冷冻干燥参数为，温度为-60～-80℃，真空度15Pa～25Pa，时间为8h～16h。