[发明专利]一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法

权利要求书

1.一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静脉，从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液及胶原酶溶液，用手术剪刀剪下消化完全的肝脏；

(2)将步骤(1)中获取的肝脏在DMEM中漂洗，剥碎，放入链霉蛋白酶与胶原酶组成的混合液中体外37℃消化10分钟，过200目细胞塞收集滤液；

(3)将步骤(2)中获得的滤液580g离心10分钟、弃上清后加入密度梯度离心液通过高速离心机1380g离心17分钟，弃上清加入GBSS/B溶液后重悬再次600g离心10分钟，将细胞沉淀接种于6孔板中，孔中加入2ml肝星状细胞培养基，然后置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

(4)细胞接种3h后，肝星状细胞开始贴壁，接种24h，大部分细胞都已贴壁，换液去除未贴壁死细胞，此后每两天进行换液。

2.根据权利要求1所述的小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)小鼠肝脏的灌流及体内消化：将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静脉，从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液和胶原酶溶液，其中，在EGTA溶液灌入3～5mL，肝脏明显变成土黄色时，剪开下腔静脉，用镊子将肝脏从小鼠体内剥离，确保周围结缔组织全部剥离完全，将剥离的肝脏放入EGTA溶液中，准备进行体外消化；

(2)体外消化与密度梯度离心：将肝脏从EGTA溶液中取出，用DMEM清洗液进行清洗，用无菌镊子将肝脏轻轻敲碎，用巴氏管吹打残余的小块肝脏组织，直到肝脏几乎为液体或黏稠状后，装入链霉蛋白酶与胶原酶的混合液中放置于37℃水浴锅里消化，消化后的小鼠肝脏通过200目细胞塞，过滤到50mL的EP管中，580g离心10分钟，弃上清，仅保留10mL在管内，再加入120uL的DNA酶，最后用GBSS/B溶液补齐至50ml，并用5mL的枪头进行重悬，放入离心机中，580g离心10分钟，离心完成后，弃上清，仅留10mL在离心管内，加入120uL DNA酶，用1mL的枪头进行重悬，用GBSS/B溶液补至16mL，然后加入8mL的密度梯度离心液，随后用5mL的枪头进行重悬，将50mL离心管中的溶液平均分入两个15mL离心管，用1mL的枪在溶液最上方轻轻覆盖一层3mL的GBSS/B，1380g离心17分钟，离心结束后，在密度梯度离心液与GBSS/B溶液的交接层会出现一层薄的白色细胞层便是肝星状细胞；

(3)肝星状细胞的培养：将中间层细胞吸至15mL离心管中，加入GBSS/B定容至15mL，重悬后放入离心机中，600g离心10分钟，弃上清，加入1mL肝星状细胞培养基重悬后接于6孔板中一孔，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养，接种后3小时可观察到出现贴壁的细胞，接种24h后大部分细胞都已贴壁，更换肝星状细胞培养基以去除为贴壁细胞及死细胞，每2天换一次；

(4)肝星状细胞的传代：一旦原代培养的细胞生长至70％-80％汇合度时，即采用胰酶消化传代，去除培养基，用不含钙镁离子的PBS进行洗涤，加入1～2mL胰酶，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中孵育1分钟，加入2～4mL含体积浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，轻柔吹打，使贴壁细胞脱落成单细胞状态，离心弃上清，加入2mL肝星状细胞培养基，按1:2的比例传代，在每1mL的细胞悬液中加入1-2mL的肝星状细胞培养基，接种于六孔板中，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。

3.根据权利要求1或2所述的小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述小鼠为12周以后成年偏肥胖的小鼠；优选地，所述结扎小鼠的上腔静脉是将小鼠用3.6％水合氯醛麻醉后，浸泡在酒精中5-10秒，随后将小鼠置于解刨板上，刨开小鼠表皮与黏膜后，用手术线将连接小鼠肝脏的上腔筋脉进行结扎；优选地，所述从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液和胶原酶溶液具体为：将静脉滞留针从门静脉扎入，以400mL/h的流速灌流EGTA溶液，EGTA溶液灌流结束后以同样流速灌流链霉蛋白酶溶液，最后以340mL/h的流速灌流胶原酶溶液。