[发明专利]去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法

权利要求书

1.一种去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)小鼠接种：在隔离饲养的清洁级小鼠脑部注射伪狂犬病疫苗种毒，接种后48h～72h，取发病死亡小鼠脑组织无菌研磨，分离伪狂犬病病毒；

(2)用细胞维持液将分离的伪狂犬病病毒液稀释，接种4个已长成细胞单层的平皿；经37℃培养箱培养1小时后，加入44℃营养琼脂，每个平皿10ml，置于含5％二氧化碳培养箱内培养；48小时后加入含0.01％中性红5ml覆盖，继续培养24～48小时后，选取产生空斑的平皿，选择小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml营养液的离心管中，经冻融后以3000r/min离心10分钟，取上清按上述方法再次进行克隆1次；

(3)病毒纯化第2次时，挑选直径约0.5mm蚀斑，按1％V/V接种已成长单层的健康细胞，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养并观察2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-40℃以下冻融若干次，取样鉴定；

(4)纯化病毒进行如下检验：

①用阳性血清中和试验法进行鉴别检验，病毒对照孔应出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均应不产生CPE；

②进行病毒含量检验，每毫升病毒含量应≥10^7.0TCID₅₀；

③按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，符合规定。

2.根据权利要求1所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的清洁级小鼠为体重16～22g昆明小鼠。

3.根据权利要求1或2所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的伪狂犬病种毒的病毒含量为10^6.5～10^7.5TCID₅₀/ml。

4.根据权利要求1或2所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的小鼠的注射剂量为0.02ml～0.05ml/只。

5.根据权利要求3所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的小鼠的注射剂量为0.02ml～0.05ml/只。

6.根据权利要求1或2或5所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的伪狂犬病病毒液稀释的病毒含量为10TCID₅₀～50TCID₅₀。

7.根据权利要求1或2或5所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(3)中的培养伪狂犬病病毒的细胞为猪睾丸细胞、BHK-21细胞、Vero细胞或鸡胚成纤维细胞中任一种。

8.根据权利要求1或2或5所述的去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法，其特征在于：所述步骤(3)中病毒接种比例V/V为1～3％，冻融次数为1～2次。