[发明专利]一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及其应用，本方法使用生物素标记的UTP(Biotin‑16‑UTP)为原料，在单磷酸尿苷酸转移酶SelO作用下，先将总线粒体蛋白进行UMP化修饰反应，被UMP化修饰的蛋白同时也带有生物素标记。后续使用生物素‑链酶亲和素Pull‑down技术将发生修饰的蛋白筛选出来，最后通过质谱确定修饰蛋白及修饰位点。本发明开发出一种简单可行的实验方法，从线粒体总蛋白中筛选出可被UMP化修饰的蛋白，为SelO蛋白及线粒体内翻译后修饰介导的信号转导提供重要的研究手段。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体地说，是涉及一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及应用。

背景技术

线粒体是真核生物特有的细胞器，其在细胞能量代谢、信号转导、细胞存亡调控中发挥重要作用，人类很多疾病都与线粒体异常有关，目前线粒体内信号转导过程还不完全被人类掌握。

SelO(Seleno O,硒蛋白O)是一种含硒蛋白，其具有线粒体定位序列，合成后存在于线粒体中。在硒缺乏的条件下，SelO蛋白的合成优先于其他硒蛋白。肿瘤组织中SelO的表达量显著低于正常组织。而且SelO高表达还是多种恶性肿瘤(如尿路上皮癌、胃癌等)较好预后的评价指标，SelO蛋白具有潜在的抑癌功能，还与软骨细胞的发育、痤疮形成等过程密切相关。SelO及同家族的蛋白均可在体外可催化自身发生单磷酸尿苷酸化修饰，说明其通过介导蛋白的单磷酸尿苷酸化修饰发挥作用。而目前真核生物中，SelO催化的单磷酸尿苷酸化修饰的底物还没有被找到，极大地限制了SelO蛋白与线粒体信号转导研究进展。因此需要一种能有效解决上述问题的线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种线粒体中单磷酸尿苷酸化修饰蛋白的筛选方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明包括以下步骤：

A通过细胞培养线粒体总蛋白后进行提取与裂解操作后获得总线粒体蛋白；

B对所述总线粒体蛋白脱盐柱处理后进行UMP化修饰反应后得到Biotn-UMP标记蛋白；

C对所述Biotn-UMP标记蛋白进行筛选后；

D所述Biotn-UMP标记蛋白通过色谱鉴定筛选确定修饰蛋白及修饰位点。

进一步地，所述筛选方法采用使用生物素-链酶亲和素Pull-down技术，生物素与琏酶亲和磁珠反应温度为25℃-30℃时间为10-20min。洗脱前需要使用洗涤液洗涤2次，洗涤液成分为：25mM Tris pH7.5,200mM NaCl。洗脱液成分为为pH 2.5的8M尿素。

进一步地，所述质谱鉴定包括所述Biotn-UMP标记蛋白在洗脱液使用12％的SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或银染后，切胶进行质谱鉴定。

进一步地，所述反应体系如下：

SelO蛋白 10μl

线粒体总蛋白 100μl

Biotin-16-UTP 10μl(反应终浓度0.5mM/L)

10×反应缓冲液 20μl

ddH2O 60μl

反应体系总共 200μl

所述反应体系中UMP化修饰反应温度为30℃，反应时间为2h以上；反应后需要加入EDTA(0.5M)终止反应；加入上样缓冲液后，进行SDS-PAGE电泳；电泳时保持20℃-35。

进一步地，所述修饰反应用到的生物素标记的UMP供体Biotin-16-UTP的分子结构如下所示：