[发明专利]检测AdipoRon对小鼠骨骼肌细胞胰岛素敏感性的方法

说明书

检测AdipoRon对小鼠骨骼肌细胞胰岛素敏感性的方法，观察AdipoRon对C2C12胰岛素敏感性的影响，使用马血清将C2C12诱导分化为成肌细胞，分为6组：空白对照组、AdipoRon高剂量组、AdipoRon低剂量组、胰岛素组以及AdipoRon低剂量+PI3K抑制剂组和胰岛素+PI3K抑制剂组，作用12h，收集上清检测葡萄糖消耗量。六孔板中将C2C12诱导分化为肌管细胞，加入药物作用12h，并用RT‑PCR法检测GLUT4的mRNA水平。本方法中，AdipoRon组和胰岛素组加入PI3K抑制剂后，GLUT4mRNA水平均有所下降，且耗糖量也减少，说明AdipoRon发挥作用可能类似于胰岛素，发挥了胰岛素信号分子的作用，激活PI3K/Akt通路，摄取葡萄糖进入细胞。目前，本方法国内外未见报道，本方法通过观察AdipoRon对成C2C12胰岛素敏感性的影响，用AdipoRon对成肌细胞的影响，表明AdipoRon能够改善胰岛素的敏感性，为糖尿病的治疗提供新方向。

技术领域

脂联素受体激动剂AdipoRon对小鼠成肌细胞株(C2C12)胰岛素敏感性的影响，并探讨其作用机制。AdipoRon能够细胞增殖的情况下增加葡萄糖消耗量。这可能是因为激活PI3K，继而影响PI3K/Akt通路，葡萄糖转运体GLUT4的功能，摄取葡萄糖进入细胞。

背景技术

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一种体内胰岛素绝对或相对分泌不足而引起的以糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱的内分泌疾病，会引起一系列的并发症，是严重危害社会和人类健康的慢性疾病之一。胰岛素抵抗(insulin resistance，肌管)是二型糖尿病发病的重要因素和显著特征，机体内胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降(主要是肝脏、肌肉和脂肪)，使得机体代偿性的分泌过多胰岛素。胰岛素敏感用于描述胰岛素抵抗的程度，通常胰岛素敏感性越低，单位胰岛素的作用效果越差，分解糖类的能力也越低。AdipoRon(脂联素受体激动剂) 通过多条信号通路，提高肌肉组织中游离脂肪酸的氧化和葡萄糖的转运速度，增加胰岛素敏感性，从而降低胰岛素抵抗的生物学作用。C2C12细胞是来源于C3H小鼠骨骼肌卫星细胞，其细胞形态和特性均一，可无限代培养，具有很好的分化能力，分化后细胞会发生明显的结构与功能性的改变，因此作为研究骨骼肌细胞增殖、代谢、损伤等成熟体外模型。通过研究 AdipoRon对肌管细胞摄取葡萄糖的过程，初步探讨AdipoRon的降糖作用机制。

发明内容

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，主要分为I型糖尿病是由胰岛β细胞破坏而导致胰岛素绝对缺乏所引起，II型糖尿病是由胰岛素相对不足所致。目前发现脂联素受体激动剂 (AdipoRon)具有抗糖尿病的生物学活性。此方法是研究其在细胞水平的胰岛素增敏和降糖作用。

在细胞水平上，胰岛素抵抗表现为胰岛素靶组织细胞(如骨骼肌细胞和脂肪细胞等)摄取和利用葡萄糖的过程中发生障碍，骨骼肌(最大的胰岛素靶器官)是利用葡萄糖产生ATP，当骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用发生障碍，又没有外界作用来刺激细胞对葡萄糖的摄取及利用就会出现胰岛素抵抗。人体内大多数组织细胞(如骨骼肌细胞)，可以利用细胞膜上的葡萄糖转运体(GLUTs)的作用摄入葡萄糖，而GLUT4通过转运葡萄糖来改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。

本实验选用源于小鼠成肌细胞株C2C12，通过低浓度马血清的作用，成功将心肌细胞诱导为成熟肌管细胞，并用gop-pod法检测细胞的耗糖量，比较细胞加入高低剂量AdipoRon和胰岛素后的培养基的葡萄糖消耗程度，发现AdipoRon在不影响细胞的活力的情况下，增加了细胞的耗糖量，从而影响了骨骼肌细胞糖代谢。结果显示：AdipoRon和胰岛素两种药物能增加肌管细胞的葡萄糖消耗量，且与对照空白组具有统计学意义。