[发明专利]谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用

说明书

本发明公开了一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用。将来源于巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点突变，所获得突变体的催化性能相较于野生型具有明显提升。基于所述突变体构建重组工程菌株，通过全细胞催化法以大宗发酵产品L‑谷氨酸为底物制备γ‑氨基丁酸，γ‑氨基丁酸产量最高达到625.6g/L，催化体系中摩尔转化率接近100％，无副产物生产。本发明所公开的谷氨酸脱羧酶突变体在γ‑氨基丁酸的高效生产制备中具有十分广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，属强神经抑制性氨基酸，具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用，在食品、医药保健、饮料加工等领域具有广泛的应用前景和市场需求。据粗略统计，目前全球各类γ-氨基丁酸总产能约6万吨/年，我国添加γ-氨基丁酸的相关产品总市值约25亿～30亿元，市场仍处于缓慢增长期。γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成、微生物发酵和生物转化法等，但是化学合成法成本高、得率低，在生产工艺中使用危险溶剂，且不能被用于食品、药品和饲料加工等领域。微生物发酵法生产周期长、生产得率较低且后续分离提取较为困难，使其工业化应用受到限制，而生物转化法由于具有操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且分离纯化成本低等优势，越来越受到青睐。

谷氨酸脱羧酶能不可逆地催化L-谷氨酸(盐)转化生成γ-氨基丁酸，是生物转化法合成γ- 氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的应用前景。目前，国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低且酶活性范围偏酸性，在环境pH＞6.0时逐步丧失其催化活性，这一特性严重影响了其在全细胞催化工艺上的应用。例如，例如专利CN103484489B记载了来源于大肠杆菌谷氨酸脱羧酶在pH＞6.0时催化活性较低，即便通过分子改造后稍扩展了其pH催化活性范围，但获得的最优突变体在pH 7.0条件下酶活力仍然远小于5U/mg，专利CN103484444B记载了来源于短乳杆菌的谷氨酸脱羧酶通过分子改造后，在pH 6.0条件下的催化活力仍不到2U/mg。专利CN105255849B记载了一种分子改造后获得的谷氨酸脱羧酶突变体，该酶在pH 4.8条件下酶活力可达到60.6U/mg，但是在近中性环境下的酶活力情况未知。

基于已鉴定的谷氨酸脱羧酶所建立的γ-氨基丁酸生物转化工艺中，γ-氨基丁酸产量多在 250-300g/L间，且需要不同离子缓冲液来控制转化体系pH值。例如根据专利CN105255849B 记载，利用一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体，在大肠杆菌中表达该酶，并全细胞转化谷氨酸18h得到283.8g/L的γ-氨基丁酸，在谷氨酸棒菌中表达该酶，并全细胞转化谷氨酸18h 得到126.7g/L的γ-氨基丁酸。专利CN102367432B中记载，利用一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌，通过分批补料进行转化实验，GABA累积浓度可达204.5g/L，摩尔转化率为97.92％。专利CN104830745B中记载，利用分泌表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌重组菌，控制转化液的 pH值为4.6～5.0并以谷氨酸钠为底物，γ-氨基丁酸产量可达203.7g/L。

因此，获得具有优良催化性能的谷氨酸脱羧酶将是解决生物转化法高效制备γ-氨基丁酸瓶颈问题的关键环节。通过筛选或改造等获得具有更高催化效率的谷氨酸脱羧酶，并在此基础上构建γ-氨基丁酸高效生产菌株，将为工业高效生产γ-氨基丁酸提供有利条件。

发明内容

本发明的目的在于提供谷氨酸脱羧酶突变体和重组菌株，并使用该菌株建立高效生产γ- 氨基丁酸的全细胞转化方法。