[发明专利]一种基于RPA对泌尿生殖道支原体的快速检测方法

说明书

本发明公开了支原体技术领域的一种基于RPA对泌尿生殖道支原体的快速检测方法，该基于RPA对泌尿生殖道支原体的快速检测方法包括如下步骤：S1：引物和探针的设计和筛选：根据MH的16SrRNA基因和gap基因，使用oligo5软件严格按照扩增试剂盒分析设计手册设计了5对引物，并进行BLAST验证，试剂盒用于筛选最佳的RPA引物，将五对引物分别对同一个MH阳性标本进行RPA扩增，每个50μl反应体系包含29.5μl的无引物复水缓冲液，本发明能够快速、灵敏、即时的检测支原体，能够有效对适龄妇女及男性进行支原体的筛查。

技术领域

本发明涉及支原体技术领域，具体为一种基于RPA对泌尿生殖道支原体 的快速检测方法。

背景技术

支原体属翻车动物纲，能自我复制，是体积是最小的，无细胞壁的原核 生物，对培养要求极高。z10其中包括解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)， 它们作为常见的共生微生物，是种机会性病原体，常引起泌尿生殖道和外生 殖道的感染。z11已有研究表明近年来解脲支原体和人型支原体在中国均呈现 较高的流行率，女性支原体总阳性率高达54.5％。z20而其中人型支原体可以 在人类口腔、呼吸道和泌尿生殖道定植，除了引发生殖器感染(尿道炎、阴 道炎、宫颈炎和盆腔炎以及不良妊娠等)，还可以诱导免疫受损患者的全身性感染(如关节炎、脑脓肿、心包炎和前列腺癌等)和新生儿感染(肺部疾病、 菌血症和脑膜炎)。Z13、z9、z19最近有研究证实支原体感染与个体性别、年 龄存在一定关系，提示对泌尿生殖道支原体进行常规筛查是必要的，尤其是 30～40岁的女性。R14然而人型支原体的培养需要专门的培养基和培养条件， 培养起来比较困难,现在实验室检测临床标本主要以培养法和聚合酶链式反 应(PCR)扩增为主.培养法虽然是金标准，但耗时耗力；聚合酶链式反应则 需要经过培训的人员和复杂仪器的分子检测，并不是所有的实验室都具备这 样的条件。Z3因此，建立一种快速、灵敏、便捷的实验室诊断方法是及其必 要的。

在过去的30年里，核酸扩增技术得到了快速发展，尤其是聚合酶链反应 (PCR)，它已经广泛应用于研究和临床实验室中。PCR主要包括变性、退火、 延伸三个步骤，从而实现了核酸靶标成百倍地扩增，起到了化学放大的作用。 Z24而这样的热循环过程在护理点和资源有限的环境等专业实验室之外的应 用受到了限制。因此，近年来等温扩增方法应运而生。由于等温扩增技术不 需要热循环仪而得到了爆发式的发展，其中包括环介导等温扩增(LAMP)z29、 z26、螺旋酶依赖扩增(HDA)Z23、z25和重组酶聚合酶扩增(RPA)r2、r3等。 已有研究将多重环介导恒温扩增技术检测泌尿生殖道支原体z22，然而由于 LAMP引物设计复杂，至少需要4-6个，扩增时间较长的特点使其受到了限制。 r16与其他等温扩增技术不同，RAA真正实现了等温操作，不需要初始变性步 骤来分离双链DNA，而是由酶和引物结合过程驱动的，利用酶和蛋白质进行核 酸扩增。RPA主要由三种核心酶组成--UvsX重组酶、单链结合蛋白(SSB)和DNA 聚合酶。首先UvsX重组酶定位于相应的靶序列，断裂目标dsDNA之间的氢键， 然后单链结合蛋白(SSB)与单链DNA结合，同时DNA聚合酶开始扩增目标DNA。 由于受到酶的影响，整个反应可以在37℃-42℃进行，在30min以内就能达到 可检测水平。R17RPA的结果呈现形式是多样的，可以通过琼脂糖凝胶电泳、 荧光定量或横向流动色谱试条显示。近十几年来，已经有越来越多的研究报 道了用于病毒r4、7、11、细菌r24、27、2、寄生虫r5、支原体r40、42、 43等病原体的RPA快速检测。

目前，RPA与LFD联用(RPA-LFD)已被证明是特异、简便、高效的，适用 于农业r36、畜牧业r34、甚至是临床医学中r25，应用范围及其广泛。与其 他等温扩增方法相比，RPA-LFD具有高度特异性和直观性，可在1h内完成。 LFD是一种用于末端测试的简单试纸，它使用标记有针对抗原的抗体的金纳米 颗粒来检测样本，可在5min内完成测试。RPA-LFD不需要特殊的设备，在资 源有限地区的现场快速检测，显示了强大的生命力。r9在本研究中，建立了 一种重组聚合酶反应结合测流试纸条检测人型支原体的特异、快速、灵敏、 简便的方法。

发明内容