[发明专利]一种柱前衍生化分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法

说明书

本发明公开了一种柱前衍生化HPLC法分析N‑(对甲苯磺酰基)‑L‑丙氨酰氯及其对映异构体的方法，采用多糖衍生物涂覆型手性色谱柱或蛋白质键合型手性色谱柱进行分析检测。该方法能够简单、准确、高效的分析检测N‑(对甲苯磺酰基)‑L‑丙氨酰氯及其对映异构体，有效控制其质量。

技术领域

本发明涉及一种色谱分析方法，尤其是一种通过柱前衍生化分析N-(对甲苯磺酰基)-L- 丙氨酰氯及其对映异构体的手性高效液相色谱法，属于分析化学领域。

技术背景

吡咯酯(化学名：3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯)或吲哚酯(化学名3-(N- 对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-吲哚)是测定白细胞的诊断试剂的常用底物，该类底物通常是通过没有旋光性的吡咯酚或吲哚酚与N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯反应后制得，因此，如何分析检测N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体，进而控制吡咯酯或吲哚酯对映异构体杂质含量，显得尤为重要。N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体结构如式(1)所示：

式1中，A：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯；B：N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰氯；

近年来，随着手性色谱填料多样化，运用手性高效液相色谱法分析手性化合物的应用日益广泛。中国专利ZL201810561999.5公开了一种HPLC法分析及制备N-(对甲苯磺酰基) -L-丙氨酸及其对映异构体的方法，由该方法可知，可以将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯先进行水解生成N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸，再使用上述方法分析分离。然而，N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯通常是通过N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸经过酰化反应制得，该化合物在制备或检测过程中，非常容易吸潮或接触水份而发生水解反应，转变为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸，因此，应用该方法并不能确定是N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸没有反应完全，还是N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯的水解产物。所以，N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸的光学纯度不能反映N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯的光学纯度，该方法不能应用于分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体。

在用手性固定相分离N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯过程中，该化合物分子中氯原子活泼，分子较容易发生酰化反应而损伤色谱柱，并且比较容易吸潮水解。因此，如何将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯进行柱前衍生化，提高化合物分子的稳定性，提高色谱分析的准确性，是目前需要解决的技术问题。

本发明的目的是为了克服现有技术不足，建立一种简单的柱前衍生化分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的手性高效液相色谱法，进而实现对其质量的控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯的方法，采用柱前衍生的方法，用手性固定相的液相色谱法进行分析检测，进而实现对N-(对甲苯磺酰基)-L- 丙氨酰氯的质量控制。

本发明提供一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，采用手性色谱柱并使用烷烃-多元醇或缓冲液-多元醇混合溶剂为流动相进行分析检测，具体步骤为：

衍生化溶液制备方法：

(1)分别将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体与衍生化试剂按摩尔比小于 1混合配制成确定浓度的混合溶液；

(2)将步骤(1)溶液超声5-10分钟，充分衍生化，得到为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的衍生物溶液；

(3)分别将步骤(2)的两个衍生物溶液稀释或否，用微孔滤膜过滤，分别得到浓度为 10mg/ml的对映异构体对照品溶液，将二者按照体积比1:1混合，得到的浓度为5mg/ml外消旋溶液作为供试品溶液。

HPLC分析方法