[发明专利]一种增强人尿源性干细胞干性的方法

说明书

本发明公开了一种增强人尿源性干细胞(human urine‑derived stem cells，hUSCs)干性的方法。在hUSCs基础培养基中添加终浓度为1.5～3μM的波尔定碱(Boldine)能够有效促进细胞在体外长期继代培养过程中OCT4基因的表达，3μM的波尔定碱能够有效促进hUSCs中MYC基因的表达，增强hUSCs的干性，从而避免hUSCs在体外培养时细胞活力下降、易衰老分化等问题，推动hUSCs的体内外研究与转化应用。

技术领域

本发明涉及一种增强人尿源性干细胞干性的方法。

背景技术

干细胞在细胞治疗和药物筛选方面有较高的应用价值。人尿源性干细胞(humanurine-derived stem cells，hUSCs)，是从人尿液中分离得到的一种具有良好增殖活性与多向分化潜能的细胞，来源广泛、获取方便且安全无创，其在一定的培养环境下能够在体外实现自我更新和克隆生长，高表达CD44、CD73、CD90、CD105和CD146等间充质干细胞表面标志物，在特殊的诱导环境下可分化为多胚层来源细胞，如肾细胞、骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞等，在泌尿系统、运动系统、神经系统的组织工程和疾病治疗中发挥重要作用^[1-2]。然而，hUSCs在体外分离培养的效率较低，且随着继代培养次数的增加，细胞干性逐渐减弱，并出现部分衰老或分化现象，这极大地制约了hUSCs的深入研究和临床应用^[3]。

目前，国内外关于hUSCs的干性调控研究相对较少，Chun等利用含有胶原蛋白(ColI)的hUSCs培养基在低氧条件下培养hUSCs，发现ColI能够有效改善细胞的增殖分化能力、染色体稳定性并提高其干性基因表达水平^[4]；Wu等研究了长链非编码RNAKCNQ1DN对hUSCs的干性调控作用，结果表明，敲低hUSCs中KCNQ1DN的表达能够促进细胞增殖并上调干性相关转录因子c-Myc、Nanog和Rex1 mRNA及蛋白的表达^[5]。与蛋白干预和基因敲除相比，小分子化合物以其结构稳定、成本低廉、操作简便等特点在体外调控干细胞的生物学行为方面发挥着重要优势^[6]，而关于小分子化合物在体外增强hUSCs干性的研究成果尚未报道。

细胞抗氧化损伤是增强干细胞干性、延缓干细胞衰老的一种有效途径^[7]。不适宜的培养条件或方式将会导致干细胞的OCT4、MYC、hTERT等干性基因表达水平下降，使干细胞逐渐出现衰老或分化现象^[8]。人尿源性干细胞hUSCs在体外长期培养过程中，其培养基内的氧分压及含氧量会逐渐增高，高氧环境下的hUSCs在氧自由基的作用下极易发生氧化性损伤，致使hUSCs发生细胞衰老、干性减弱等不良后果。因此，实现干细胞抗氧化损伤培养将有利于增强hUSCs的干性、延缓细胞衰老，使hUSCs长期保持较高的细胞活力。有研究表明，异喹啉类生物碱波尔定碱(Boldine)(图1)具有较强的抗氧化活性，且经细胞与动物模型水平论证其抗氧化活性具有良好的细胞保护作用^[9]。然而，波尔定碱在干细胞领域的研究目前相对较少，基于波尔定碱的高抗氧化活性研究其对hUSCs干性的影响有利于进一步拓宽波尔定碱的药理作用范围，同时有助于开发出增强hUSCs细胞干性和延缓hUSCs细胞衰老的药物，增强hUSCs等人成体干细胞的体外长期继代培养能力和提高其临床应用价值^[10]。

发明内容

本发明旨在提供一种有效增强人尿源性干细胞干性的方法。

收集健康成人无菌尿液200～300mL，常温离心，利用自制简化的hUSCs基础培养基分离培养hUSCs。

hUSCs基础生物学特征鉴定，经倒置相差显微镜观察细胞形态、流式细胞术鉴定细胞表面标志物、四甲基噻唑蓝(MTT)法测定细胞活力。

经鉴定得到细胞形态正常、细胞活力良好的hUSCs，在其基础培养基中添加1.5～3μM的波尔定碱实现hUSCs干性的有效增强。