[发明专利]吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶及其重组表达方法和应用

权利要求书

1.一种吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示核苷酸所编码。

2.如权利要求1所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或3所示。

4.含有如权利要求2或3所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，出发载体为pCold TF载体。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述编码基因由TF或cspA启动子可操纵控制。

7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述编码基因不包括信号肽编码序列。

8.含有如权利要求4至7任一项所述的重组载体的重组细胞。

9.一种表达如权利要求2或3所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：将不包括信号肽的所述编码基因克隆到pCold TF载体，转化获得重组表达细胞，培养所述细胞，诱导表达后收集表达产生的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述重组表达细胞为大肠杆菌。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，培养前包括菌种活化步骤，即在200 rpm摇动下，将阳性转化子在包含氨苄青霉素的LB培养基中于过夜活化。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，将活化菌种转接到pH为5.6-6.6的LB培养基中180-220 rpm、35-39°C震荡培养5-8小时，向培养物中加入IPTG以诱导所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的表达，诱导表达时间10-14小时。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，诱导时的培养温度为18-22℃，诱导蛋白质表达12小时；活化菌种的接种量为 0.8-1.2％。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，将活化菌种转接到pH为5.9的LB培养基中200 rpm、37°C震荡培养6小时，向培养物中加入500 µmol / L IPTG以诱导所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的表达。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述诱导温度为20℃，诱导蛋白质表达12小时，接种量为1％。