[发明专利]用于测定胚胎质量的方法

说明书

本发明总体上涉及生殖医学领域。更具体地，本发明涉及用于通过测定细胞游离的核酸水平和/或测定核酸提取物中至少一种特定核酸序列的存在和/或表达水平来测定胚胎质量的体外无创方法和试剂盒。

本申请是申请号为201480045819.8、申请日为2014年6月18日、发明名称为用于测定胚胎质量的方法的申请的分案申请。

技术领域

本发明总体上涉及生殖医学领域。更具体地，本发明涉及用于测定胚胎质量的方法和试剂盒。

背景技术

目前，在辅助生殖技术(ART)中没有用于测定胚胎质量的可靠的可商购的遗传或非遗传的程序。尤其是，当转移至合适的子宫环境时，测定胚胎是否能够产生存活后代仍然是一个重要问题。另一个重要问题是测定将使胎儿以及甚至在孩子存活后发育的胚胎的基因谱。

选择具有高移植潜力的胚胎是辅助生殖技术(ART)中的主要挑战之一。最初，使用多胚胎移植(MET)来使怀孕率最大化。然而，胚胎质量的提高和多胎妊娠率的增加造成用于替代的胚胎数量减少。因此，选择“最佳”胚胎成为关键，尤其强烈推荐使用选择性单胚胎移植(SET)。因此，需要开发用于胚胎选择的新的客观的方法。在IVF和ICSI条件下选择健康胚胎的传统方法基于主观的形态学标准，比如破碎化程度和多核的存在、卵裂球的数量和大小、早期胚胎分裂(Ebner等,2003；Fenwick等,2002)。然而，大多数研究表明，仅具有合适形态学外观的胚胎不足以预测成功的移植。考虑到形态学评估和细胞遗传学筛选方法的局限性，现在朝着更复杂、高通量的技术发展，出现“组学”科学，例如转录组学和代谢组学。这些方法关注各种身体细胞和胚胎培养基。我们的团队使用卵细胞(CC)基因表达的转录组学数据已经报道了用于预测胚胎和妊娠结果的间接且具有吸引力的方法(Assou等,2011；Assou等,2008)。我们观察到胚胎形态学方面和CC基因表达谱之间没有关系(Assou等,2010)。其他研究报道，用Raman或近红外(NIR)光谱检测的旧培养基的代谢谱与个体胚胎的生殖潜能相关(Seli等,2007；Vergouw等,2008)。他们还表明，来自胚胎的培养基的代谢谱与形态学无关。

移植率降低的另一个主要原因是移植胚胎的遗传质量差。例如，大多数胚胎损耗和损失由非整倍体(染色体数量异常)造成，所述非整倍体是致死的，且在所有自然流产和死胎的大约60％中出现。其他遗传畸形包括染色体非整倍体、扩增、易位、插入/缺失、倒位、短串联重复序列多态性、微卫星多态性、单核苷酸多态性(SNP)和其他结构异常。遗传畸形可以导致很多表型疾病，一些甚至是致死的。如果遗传畸形在胚胎中出现，可能发生很多类型的产前病症和先天性疾病。通过着床前遗传学诊断(PGD)筛选这些畸形非常重要，以确保选择结构上正常的胚胎和存活移植。然而，目前的方法是创伤性的，可能对胚胎产生损害。

据报道，在生物液体例如血液、腹水、尿液、羊水、粪便、唾液或脑脊液中可以检测到细胞游离的DNA。各种核酸，例如DNA、RNA、miRNA实际上是分离的，并且以细胞游离的形式被检测到。发现cfDNA在健康受试者中是可检测的量，且在一些病理性疾病(癌症、心肌梗塞、自身免疫性疾病、脓毒症、创伤……)或特殊生理状态(紧张的工作……)中含量更高。cfDNA的释放机制知之甚少，但已经表明可能涉及坏死、细胞凋亡、吞噬作用或主动释放。CfDNA分析是诊断领域中的主动研究领域，尤其是两个领域目前正经历仔细审查。然而，还没有研究用于测定胚胎质量的cfDNA检测。

发明简述

本发明是基于以下重大发现：培养基中存在一定量的细胞游离的核酸，其中胚胎在体外受精条件下生长。发明人表明，所述培养基中细胞游离的核酸的水平为胚胎引起怀孕的能力提供信息。此外，发明人表明，分析所述细胞游离的核酸使得检测和表达特定序列的基因表达成为可能，为开发用于胚胎遗传识别的无创方法作铺垫。

发明详述