[发明专利]一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用

说明书

本发明提供一种携带修饰的小RNA的建库方法，至少包括如下步骤：1）利用去甲基化试剂去除携带修饰的小RNA的甲基化修饰；2）利用第一转化剂使携带修饰的小RNA的5’端的5’‑OH转化为5’P，3’P端转化为3’‑OH；3）利用第二转化剂使携带修饰的小RNA的5’端的5‑cap转化为5’P；4）将携带修饰的小RNA上连接测序接头；5）利用包括逆转录酶在内的逆转录试剂将携带修饰的小RNA反转录成cDNA；6）将cDNA纯化后进行PCR扩增，获得携带修饰的小RNA的测序文库。本发明提供了一种新的小RNA建库方法为携带修饰的小RNA提供了一个强大的灵敏的分析工具进而为生命体内丰富复杂的携带修饰小RNA的功能及其在生理病理等过程中的角色扮演奠定坚实的研究基础。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用。

背景技术

非编码RNA中包含多种小RNA如siRNA、miRNA、piRNA等，它们组成了细胞中高度复杂的小RNA调控网络，在调节个体发育、细胞增殖分化、肿瘤的发生发展及抗病毒等整个细胞水平几乎所有事件中起着重要的调控作用。

近年来随着高通量RNA测序(RNA-seq)技术的发展，我们认识了细胞中丰富的RNA世界。同时大量的新类型的小RNA在不同的物种中被发现和报道，其中有tsRNA(tRNA来源的小RNA)，rsRNA(rRNA来源的小RNA)，rasiRNA(重复相关的siRNA)，hcRNA(异染色质RNA)和PASR/TASR(启动子终止子相关的小RNA)等。传统的RNA-seq是在RNA的末端加上接头，再利用与3’端接头互补的引物进行逆转录。这种方法适用于结构特征为5’-磷酸基团，3’-羟基基团的转录本，绝大多数miRNA符合此类结构，故针对miRNA的测序技术相对成熟。然而，对于末端或内部携带修饰的小RNA，由于其会干扰末端接头的连接或阻碍反转录进程，从而使得大量带修饰的小RNA不能被成功建库，进而被当做垃圾片段而忽略。2015年《NatureMethods》上的两篇文章通过在文库制备前用酶处理去除tRNA的修饰，解决了tRNA测序的技术难题。同时，该方法发掘了大量携带甲基化修饰核苷的tRNA-fragment。很多研究表明tRNA也能被切割成更小的RNA，其丰度甚至比microRNA更丰富。tRNA-fragment的相关研究表明其参与了细胞增殖，肿瘤形成，干细胞发育，跨代遗传等过程。这些研究成果都说明，生命体中存在着丰富的携带修饰的小RNA，它们蕴藏大量的生物学信息与机体发育，肿瘤形成等多种生理病理的发生发展密切相关，亟待进一步被发掘研究。

建立能够捕获末端及内部携带修饰的小RNA建库方法是发掘和完善小RNA及深入研究其潜在功能的首要待攻克技术壁垒。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种携带修饰的小RNA的建库方法及其应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种携带修饰的小RNA的建库方法，至少包括如下步骤：

1)利用去甲基化试剂去除携带修饰的小RNA的甲基化修饰；

2)利用第一转化剂使携带修饰的小RNA的5’端的5’-OH转化为5’P，3’P端转化为3’-OH；

3)利用第二转化剂使携带修饰的小RNA的5’端的5-cap转化为5’P；

4)将携带修饰的小RNA上连接测序接头；

5)利用包括逆转录酶在内的逆转录试剂将携带修饰的小RNA反转录成cDNA；

6)将cDNA纯化后进行PCR扩增，获得携带修饰的小RNA的测序文库。

本发明第二方面提供前述携带修饰的小RNA的建库方法在基因测序领域中的用途。