[发明专利]一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合及其应用

权利要求书

1.一种将肝细胞诱导为肝癌细胞的基因组合，其特征在于，所述基因组合包括TP53突变基因和c-MYC基因。

2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于，所述基因组合还包括NRAS突变基因、KRAS突变基因、Hyper-IL6基因、BRAF基因、CTNNB1基因或ERBB4基因中的任意一种或至少两种的组合，优选为NRAS突变基因和/或KRAS突变基因；

优选地，所述肝细胞包括人原代肝细胞。

3.一种基因转染载体，其特征在于，所述基因转染载体含有权利要求1或2所述的基因组合；

优选地，所述基因转染载体为基因过表达载体，包括慢病毒载体、Piggybac载体或TetOn诱导性载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

4.一种人肝癌细胞，其特征在于，所述人肝癌细胞为基因组中整合有权利要求1或2所述的基因组合的人原代肝细胞；

优选地，所述人肝癌细胞中包括权利要求3所述的基因转染载体。

5.一种人肝癌细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

采用携带权利要求1或2所述的基因组合的慢病毒载体和包装质粒共转染包装细胞，得到慢病毒溶液；

以人原代肝细胞为母细胞，将所述慢病毒溶液与人原代肝细胞混合培养，在所述人原代肝脏细胞过表达所述基因组合，诱导肝癌形成得到所述人肝癌细胞。

6.根据权利要求5所述的人肝癌细胞的构建方法，其特征在于，所述包装细胞包括293T细胞或PlatE细胞；

优选地，所述慢病毒载体与包装质粒的质量比为(2～4):5，优选为3:5；

优选地，所述包装质粒包括psPAX2和pMD2.G；

优选地，所述psPAX2和pMD2.G的质量比为(3～5):1，优选为4:1；

优选地，所述混合培养的时间为36～60h，优选为48h；

优选地，所述人原代肝细胞与慢病毒溶液混合前经过预处理，所述预处理的操作为：将所述人原代肝细胞置于肝细胞培养基中，培养24～48小时；

优选地，所述人原代肝细胞的培养条件为在36～37℃、4.5～5.5％CO₂下培养。

7.一种原发性肝癌人源化动物模型，其特征在于，所述人肝癌模型为移植有权利要求3所述的基因转染载体感染的人原代肝细胞的生物体；

优选地，所述生物体为肝脏自发或可诱导损伤的免疫缺陷动物，包括TK-NOG、uPA-SCID、FRG、FRGN或NSIF中任意一种免疫缺陷小鼠，优选为NSIF小鼠。

8.一种构建原发性肝癌人源化动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括：

以人原代肝细胞为母细胞，并用携带权利要求1或2所述的基因组合的慢病毒载体和包装质粒共转染包装细胞，得到慢病毒溶液；

再将所述慢病毒溶液与人原代肝细胞混合培养，再经体外培养确认基因组合转入后、肝癌细胞形成前移植到实验动物体内，饲养后得到所述原发性肝癌人源化动物模型。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实验动物包括肝脏自发或可诱导损伤的免疫缺陷实验动物；

优选地，所述实验动物包括TK-NOG、uPA-SCID、FRG、FRGN或NSIF中任意一种的免疫缺陷小鼠；

优选地，所述免疫缺陷小鼠为Fah-/-缺陷的免疫缺陷小鼠，优选为NOD-SCID IL2rg-/-Fah-/-小鼠；

优选地，所述移植的方法包括脾脏注射或肝原位注射；

优选地，所述饲养的时间为60～180天，优选为120～180天；

优选地，得到所述原发性肝癌人源化模型后还包括病理鉴定的操作；

优选地，所述病理鉴定包括：肿瘤形成后，解剖剥取小鼠的肝脏或脾脏组织，检测组织病理特征和肿瘤所属类型。

10.如权利要求1或2所述的基因组合、权利要求3所述的基因转染载体、权利要求4所述的人肝癌细胞或权利要求7所述的原发性肝癌人源化动物模型在研究肝癌发病机制、筛选肝癌药物或评估肝癌治疗手段中的应用。