[发明专利]一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法，为了构建嗜水气单胞菌的DNA疫苗，我们根据已发表的该菌的外膜蛋白基因momp的核苷酸序列设计一对特异性引物，应用PCR技术，扩增到嗜水气单胞菌L316的主要外膜蛋白基因，并插入到真核表达载体pcDNA3上，构建成DNA疫苗，命名为pcDNA3‑POMP；以纯化的原核表达蛋白GST‑POMP免疫SD大鼠制备抗血清，用ELISA测定了抗体效价达到1：100000以上；用pcDNA3‑POMP质粒转染293细胞，转染48小时后收集细胞，提取细胞的RNA进行RT‑PCR，检测到外源基因的表达。至此，初步完成了嗜水气单胞菌DNA疫苗表达载体的构建，为进一步的疫苗免疫和效价检测奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物抗体的领域，具体涉及一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是重要的人畜、水生生物共患病的致病菌，是引起欧洲鳗鲡暴发性败血症的主要病原菌之一；目前已经报道的嗜水气单胞菌疫苗包括：全菌灭活苗，菌体成分亚单位苗，减毒活疫苗；嗜水气单胞菌血清型很多，全菌灭活疫苗只对相同血清型的菌株攻击具免疫力；而且嗜水气单胞菌抗原结构复杂，全菌苗经灭活后抗原性常发生变异；全菌苗颗粒大，它被吸收的可能性也小于亚单位苗[1]；

DNA疫苗是将含有编码某种抗原蛋白的外源基因与质粒重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的；DNA疫苗具有许多优点，例如设计操作简便，生产成本低，便于运输和保存，安全性高，可以不加佐剂，使用方便等等，使得DNA疫苗受到越来越多的重视，被称为第3代疫苗[2]；

第一个鱼类DNA疫苗是1996年，Anderson等[3]报告了带有(infectioushematopoietic necrosis virus)IHNV糖蛋白基因的质粒能够在rainbow trout虹鳟肌肉组织中表达，并且该DNA疫苗能够保护免疫鱼抵抗IHNV病毒的感染[4]；此后的一些实验证明，在多种鱼体内，外源基因不仅能够高效、持久地表达，而且能够引起宿主鱼类对外源蛋白的免疫应答:例如虹鳟鱼DNA疫苗的攻毒实验中，Lorenzen等[5]构建了带有VHSV(Viralhemorrhagic septicemia virus)病毒G蛋白基因的DNA疫苗，可以达到78％的保护率；Pasnik[6]等构建了海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)分泌性fibronectin结合蛋白的DNA疫苗，在银花鲈鱼(Stiped bass)中50g的注射量可以达到90％的保护率；2004年Mikalsen等[7]用IPNV(infectious pancreatic necrosis virus)的VP2基因DNA疫苗25g免疫大西洋鲑鱼(Salmo salar)可以获得84％的保护率；

外膜蛋白(Outer Membrane Protein，OMP)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构；气单胞属细菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可激发宿主产生体液免疫，也能诱导细胞介导的免疫；而且，由外膜蛋白诱导产生的免疫力对其它血清型的嗜水气单胞菌具有交叉保护作用，是一种潜在的共同保护性抗原；

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体及其制备方法；选择嗜水气单胞菌的外膜蛋白基因momp为研究对象，构建其DNA疫苗质粒，在293细胞上进行真核转染并检测了外源基因的表达，为进一步研究该疫苗在鱼体上的免疫反应机制，考察疫苗的保护效果奠定基础；

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原制备卵黄抗体的制备方法，包括以下制备方法：