[发明专利]新型冠状病毒全基因组的扩增引物和方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种新型冠状病毒全基因组的扩增引物和方法。新型冠状病毒的检测引物组包括36对扩增引物，具体序列如SEQ ID NO.1‑72所示。本发明提供的检测引物组可以实现对新型冠状病毒的较均匀覆盖，在纳米孔测序和高通量测序中，均实现了所有扩增区域100倍的覆盖深度。本发明提供的新型冠状病毒全基因组的测序片段制备方法简便易操作，扩增效果好，适用测序平台广泛，成本较低。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒全基因组的扩增引物和方法。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)全基因组数据在疫情应对中发挥了重要作用。比如，第一株毒株基因组在短时间被测序，确定了病原，为检测试剂盒开发提供了参考数据；目前，全球多个国家对病毒展开的测序工作，揭示了SARS-CoV-2在传播过程中形成的谱系，并实时更新，这对了解不同地区的疫情特点和监控病毒传播等工作具有巨大的促进作用。

病毒全基因组级别的测序技术方案主要有宏转录组无偏性测序、病毒全基因组PCR扩增子测序和病毒基因组特异性探针杂交捕获测序三种。

宏转录组无偏性测序是指直接对临床样本的提取的总RNA进行测序，但由于咽拭子、鼻拭子等临床样本中含有大量的宿主和定植菌群的序列，会导致SARS-CoV-2检测敏感度很低，且对测序数据量要求巨大，在无特别需求时不作常规使用。病毒全基因组PCR扩增子测序即采用针对SARS-CoV-2的多重扩增引物放大其基因组各区域，再通过高通量二代测序或纳米孔单分子测序技术获得完整的病毒基因组序列。除了扩增方案，目前应用于新冠病毒的高通量测序还有探针捕获的方法，比如华大智造公司就采用了113对特异探针通过高通量测序技术来捕获长度为257bp-398bp之间的SARS-CoV-2的基因组片段，然而该方法的实验周期长，操作复杂，对于病毒载量较低的样本敏感度也不如扩增子测序法。所以，目前扩增子测序法仍是应用最广的方法。

但是，SARS-CoV-2基因组的扩增测序方法还是存在以下两个主要问题：

(1)不同扩增子之间的偏性较大。由于目前多重扩增体系的PCR引物过多，不同扩增子的效率存在差异，造成部分基因组部分区域的测序覆盖不足，而部分区域又出现了冗余的超高覆盖。比如，ARTIC工作流推荐的扩增引物体系应用最广，共有96对引物，扩增子长度从406bp至491bp不等。其测试结果显示，不同扩增子存在明显差异，对于一些病毒载量较低的样本，存在着部分引物对没有相应的扩增产物，而少量优势引物被大量扩增的情况。这种扩增偏性也同时在高通量测序和纳米孔测序中出现。扩增子的覆盖偏性导致部分重要的病毒谱系划分位点的测序覆盖深度不足，比如划分病毒A、B谱系(又称S、L谱系)8782位点。

(2)扩增产物较短，限制了纳米孔测序能力的发挥。为了结合高通量测序平台，目前扩增体系的产物长度约300～400bp。但高通量测序由于仪器较为昂贵、对实验室环境要求较高，通常需要将样品运送到有条件的机构进行高通量测序。除了这些情况外，运输增加了额外的步骤，降低了获得基因组序列的时效性。然而，纳米孔测序技术实现了便携性，其中MinION测序仪只有手掌大小，连接笔记本电脑即可测序，可以在疫情现场进行快速检测并获得病例感染的毒株基因组，给疾控工作和临床工作提供更为便捷的技术支持。但目前依赖短扩增子测序的方法限制了纳米孔的长读长测序能力的发挥。

目前，仍缺乏一种针对SARS-CoV-2的全基因组扩增技术，以实现更均匀的基因组覆盖和更长的测序读长，此技术将更具有实际的应用价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种新型冠状病毒的检测引物组。

本发明的第二目的在于提供上述新型冠状病毒的检测引物组的应用。

本发明的第三目的在于提供一种新型冠状病毒的检测试剂。