[发明专利]一种基于高分辨熔解曲线形状鉴别15种动物源性成分的单管检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于高分辨熔解曲线形状鉴别15种动物源性成分的单管试剂盒及检测方法，技术方案为：一种基于高分辨熔解曲线形状鉴别15种动物源性成分的单管试剂盒及检测方法，包括对4对通用引物筛选优化，选取两对通用引物加入到同一扩增体系中，分别以黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、马、驴、猪、狗、猫、鼠、狐、貂、貉15种哺乳动物源性成分为模板进行PCR‑HRM实验，采集物种全部的熔解曲线信息，经统计处理后可以实现对15种动物源性成分准确鉴别。本发明以物种的熔解曲线作为特定目标物种识别的唯一指纹，建立了一种基于两对通用引物的单管、快速、低成本、无污染、高通量的15种动物源性成分以及常见混合物种的检测方法。

技术领域

本发明属于肉及肉制品安全检测领域，具体涉及一种基于高分辨熔解曲线形状鉴别15种动物源性成分的单管试剂盒及检测方法。

背景技术

多重PCR技术是1988年由Chambehian在普通PCR基础上首次提出来的一种新型DNA扩增技术，其反应基本原理与普通PCR原理相同，区别是它可以实现在同一反应体系中对多个目标片段进行同步扩增。因为该技术可以在单管中检测多个目标物，大大减少了时间和成本，因此成为了很多研究者的热点。

目前基于多重PCR反应体系鉴别多种动物源性成分主要是利用多对特异性引物，由于在一个管子里引物数量较多会引起引物之间发生竞争，增加了反应的难度，降低了扩增效率，同时也限制了在单管中检测更多物种的可能性。

根据PCR产物分析方法的不同，目前基于多重PCR应用于多种动物源性成分检测的方法主要有4种：荧光探针法、熔解曲线法、电泳法、RFLP法。其中探针法虽然特异性更强，但是设计探针增加了反应成本；电泳法简单易操作，同时也会带来污染的风险；相比较而言熔解曲线法可以避免这些问题，可以在闭管中同时实现对物种的鉴定，但普通熔解曲线也存在分辨率低、PCR抑制等问题。

高分辨熔解曲线相比于传统的熔解曲线，其熔解速率高出一个数量级，在温度每变化1℃可以获得高密度的数据，从而可以在样本之间检测至单个核苷酸变异；相比于传统熔解曲线根据物种的熔解温度鉴别方法，整个高分辨熔解曲线信息在区分更多的物种中提供了更大的优势，更有利于物种的准确鉴别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高分辨熔解曲线形状鉴别15种动物源性成分的单管检测方法及试剂盒。优化筛选两对通用引物加入到同一扩增体系中，利用物种全部的熔解曲线信息，并且借鉴统计学的数据处理分析方法，建立一种单管、快速有效检测肉及肉制品中15种哺乳动物以及常见的混合物种的鉴别方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于高分辨熔解曲线形状鉴别15种动物源性成分的单管检测试剂盒，包括4对通用性引物、PCR反应混合液、饱和荧光染料、双蒸水、15种哺乳动物对照品的高分辨熔解曲线信息、两个标准鉴别图谱、常见混合物种掺假鉴别的标准图谱以及线性标准方程；

所述的通用性引物具体序列为：

97bp对应的引物序列为：

上游引物：5'- CAGACATCTG GTTCTTTCTT CAGGGC -3'

下游引物：5'-GGGCTGATTA GTCATTAGTC CAT -3'

140bp对应的引物序列为：

上游引物：5'-TCCCAGTACG AAAGGACAAG A-3'

下游引物：5'-CAATTACCGG GCTCTGCCA-3'

230bp对应的引物序列为：

上游引物：5'-ACAAGACGAG AAGACCC-3'

下游引物：5'-GATTGCGCTG TTATCCC-3'