[发明专利]绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法及其应用

权利要求书

1.绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于，该方法包括：

步骤一：人绒毛膜癌细胞JAR株，复苏后用PRMI-1640培养液于37℃、5％CO₂条件下培养；

步骤二：取对数生长期JAR细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使其作用浓度为0.1μg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；

步骤三：适当增加VP16的作用浓度，在37℃、5％CO₂条件下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；

步骤四：重复步骤三直到获得能在3μg/ml VP16中稳定生长、传代及复苏的JAR/VP16细胞株；

步骤五：稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。

2.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤一中PRMI-1640培养液含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml。

3.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述步骤三中每阶段增加VP16量为0.5μg/ml，依次为0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml。

4.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤五中的冻存液由20％小牛血清、10％DMSO、70％PRMI-1640培养液组成。

5.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤五中冻存过程逐步降温，采取4℃30分钟→-20℃1小时→-70℃过夜→液氮的顺序进行。

6.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法，其特征在于：所述的步骤五中冻存细胞的复苏按以下步骤进行：从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动，使冻存物在1分钟内解冻；取10ml离心管，将冻存液加入离心管后加入4ml培养液，5000g离心5分钟后弃去上清，用4ml培养基重悬细胞，后将细胞悬液加入25cm²培养皿，加入10ml含有10％小牛血清的培养液；轻微摇动混匀，放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO₂条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液。

7.根据权利要求1所述的绒毛膜癌耐药细胞株的建立方法在研究耐药细胞生物学行为、多药耐药机制、筛选敏感性化疗药物、评价耐药方案等提供细胞模型的应用。