[发明专利]小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法及其应用

权利要求书

1.小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、静脉注射抗CD45抗体

小鼠经内眦静脉丛注射抗CD45抗体，注射剂量为3-5μg/只，注射后2.5min眼球取血，3min断颈处死小鼠并解剖取材，包括淋巴组织和非淋巴组织；

S2、制备单个核细胞

分别制作S1获得的外周血及解剖获取组织的单个核细胞；

S3、制备流式样本

取S2单个核细胞的悬浮液置于流式管中，并向其中加入抗体，室温避光15-20min，PBS缓冲液洗涤细胞、离心、弃上清、PBS缓冲液重悬细胞，置于流式细胞仪上检测；

S4、分析血管内外淋巴细胞标记情况

采用流式细胞术分析单个核细胞血管内外的CD45⁺百分比，并以此识别淋巴组织或非淋巴组织中淋巴细胞的位置。

2.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S1中解剖获取的淋巴组织为淋巴结、脾脏和骨髓，非淋巴组织为肝脏和肺脏。

3.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S1中注射剂量为3μg/只。

4.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S2中单个核细胞的制备方法为：

(1)外周血单个核细胞

小鼠眼球取血后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；

(2)淋巴结、脾脏单个核细胞

分别将淋巴结、脾脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，分别吸取二者的悬浮液，离心后去上清；其中，淋巴结细胞残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存，脾脏细胞残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；

(3)骨髓单个核细胞

取双侧腿和坐骨，分离胫骨、股骨和坐骨，PBS缓冲液冲出骨髓，吹散后离心、去上清，残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；

(4)肝脏单个核细胞

取肝脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，吸取细胞悬液离心后取上清，转移上清液后离心、去上清，残液弹起后采用40％细胞分离液重悬，然后将悬液加入80％细胞分离液中，升3降3离心，中间细胞层即为单个核细胞，PBS缓冲液洗涤、离心去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存；

(5)肺脏单个核细胞

取肝脏混合PBS缓冲液置于筛网中研磨直至筛网中只剩结缔组织，吸取细胞悬液离心后去上清，残液弹起后加入小鼠红细胞裂解液室温裂解，然后加入PBS缓冲液终止裂解，离心、去上清，残液弹起PBS缓冲液洗涤、离心去上清，残液弹起后加入PBS缓冲液冰上保存。

5.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S3中加入的抗体为CD45-BV570或CD45-APCcy7。

6.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S3中抗体采用荧光标记。

7.根据权利要求1所述的小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法，其特征在于，S4中淋巴组织血管内CD45^-群较CD45⁺占主要成分，而非淋巴组织血管内CD45⁺群较CD45^-群占主要成分。

8.权利要求1-7任一所述小鼠血管内外淋巴细胞识别的方法在判断小鼠淋巴细胞浸润程度中的应用。