[发明专利]一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用。该大肠杆菌底盘菌的制备方法为：提高宿主菌(大肠杆菌或突变型大肠杆菌)中四氢吡啶二羧酸：N‑乙酰转移酶、N‑乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、N‑乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、O‑乙酰同型丝氨酸硫解酶和同型丝氨酸：O‑乙酰转移酶的表达量和/或活性，且降低所述宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N‑琥珀酰转移酶和同型丝氨酸：O‑琥珀酰转移酶的表达量和/或活性，从而获得无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌。实验证明，该大肠杆菌底盘菌可以减少碳丢失率，提高以中心代谢中间产物(如乙酰辅酶A、丙酮酸、α‑酮戊二酸)为前体合成目标产品的能力。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用。

背景技术

三羧酸循环(TCA cycle)是大肠杆菌中心碳代谢的重要组成部分。众多生物基化学品的生物合成都依赖于三羧酸循环中间代谢物α-酮戊二酸。同时敲除大肠杆菌三羧酸循环中的α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)和异柠檬酸裂解酶基因(aceA)，迫使更多α-酮戊二酸流向目的产物合成，是促进目标产品合成的最佳方式。

大肠杆菌在无机盐基础培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行有氧生长时，三羧酸循环承担着彻底氧化碳源为细胞生长提供能量与还原力的功能，也提供了众多的细胞生长必需的代谢物。如果同时敲除α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)和异柠檬酸裂解酶基因(aceA)，或敲除sucA，破坏三羧酸循环代谢，往往导致菌株生长缓慢，特别是在无机盐基础培养基中以葡萄糖为唯一碳源的有氧生长受到限制。目前，解决的主要策略有两种：一是对α-酮戊二酸脱氢酶基因(sucA)的表达进行动态调控，在细胞生长和目标产品的合成中进行开关调控，这种策略中的调控元件过于复杂，往往影响了目的产物合成途径，而且过程复杂难以进行工业化应用；二是利用α-酮戊二酸依赖的双加氧酶重构三羧酸循环，将目标产品的生产与工程菌的生长关联起来，这对α-酮戊二酸依赖的双加氧酶活力有较高要求，而且不适用于生产有一定细胞毒性的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌，使菌株在三羧酸循环中断或无三羧酸循环的情况下，在无机盐基础培养基中能以葡萄糖或甘油为唯一碳源的有氧生长。

本发明首先保护制备无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌的方法，可包括如下步骤：提高宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶和同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的表达量和/或活性，且降低所述宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-琥珀酰转移酶和同型丝氨酸：O-琥珀酰转移酶的表达量和/或活性，从而获得无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌；

所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。

上述方法中，所述无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌可在无机盐基础培养基以葡萄糖或甘油为唯一碳源有氧生长。

上述方法中，所述四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶、所述N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、所述N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、所述O-乙酰同型丝氨酸硫解酶和所述同型丝氨酸：O-乙酰转移酶均来源于Bacillus subtilis subsp.subtilis 168。

上述方法中，所述“提高宿主菌中四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶和同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的表达量和/或活性”是通过向所述宿主菌中导入四氢吡啶二羧酸：N-乙酰转移酶的编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸脱乙酰基酶的编码基因、N-乙酰二氨基庚二酸氨基转移酶的编码基因、O-乙酰同型丝氨酸硫解酶的编码基因和同型丝氨酸：O-乙酰转移酶的编码基因来实现的。