[发明专利]尿激酶受体稳定突变体suPARcc在真核胞外蛋白表达中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及可溶性尿激酶受体突变体suPAR^H47C/N259C(suPARcc)在真核胞外蛋白表达中的应用，具体是通过融合表达的方式提高外源蛋白质的表达量，同时利用suPARcc与配体ATF的高亲和性，利用ATF亲和柱从大体积的发酵液中直接高效地捕获目的蛋白。本申请是将suPARcc和常规蛋白酶切位点整合至真核表达系统载体，获得suPARcc基因融合表达载体。待表达的目的基因和suPARcc基因以正确阅读框融合，构建融合表达重组质粒。融合表达重组质粒经转染和稳定细胞系筛选，在真核细胞经诱导分泌表达获得含标签和目的蛋白的融合蛋白，融合标签最后可以通过常规蛋白酶去除。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及尿激酶受体稳定突变体suPARcc在真核胞外蛋白表达中的应用。

背景技术

随着基因工程技术、基因组学和蛋白质学技术的发展，重组蛋白已经广泛应用于生物、医药、农业和畜牧兽医等领域。然而，大规模有生物学活性真核蛋白的获得仍然是重组蛋白技术中的难点。重组蛋白的表达系统有原核和真核两大类。以大肠杆菌为代表的原核表达系统具有表达量高、易操作和生产成本低等优点，但在表达需要复杂翻译后修饰的真核蛋白时，往往无法得到有生物学活性的蛋白。真核表达体系特别是昆虫和哺乳动物细胞等表达体系能对蛋白进行复杂的翻译后修饰，是真核重组蛋白表达的有利工具，在基础科学及医药领域发挥了重要的作用。

然而目前的昆虫和哺乳动物细胞表达系统在表达真核胞外蛋白时还有一些缺陷。目的蛋白纯化时主要采用经济实惠的镍填料进行第一步的捕获。真核细胞无血清培养液悬浮培养时，培养液中一些成分会将镍离子从常规的镍填料上脱落，从而影响纯化效果。虽然目前一些公司也推出了与镍离子强结合的镍填料，如Ni-excel或Ni-Penta，但它们只剩一个手臂与六组氨酸标签蛋白结合，当蛋白与镍离子结合能力较弱或表达量低时，这些填料并无法有效地从培养液中直接捕获目的蛋白。而真核生物常使用的另外一些标签，如c-myc和FLAG等，在通过亲和层析纯化目标蛋白时用到的是抗体亲和柱，在规模化制备和纯化蛋白时，存在成本高的缺点。

使用高亲和力融合标签，是解决这一问题的关键所在。这种融合标签的选择应具备以下的特征：1）自身在真核系统中能高效表达，最好同时可增加目的蛋白表达水平；2）结构稳定，不受目的蛋白的影响，也不影响目的蛋白的构象；3）标签与目的蛋白之间存在蛋白酶切位点，以便捕获后标签的去除；4）标签相应的亲和配体结构稳定而容易获得，以降低亲和柱的成本。

以可溶性尿激酶受体为蛋白表达和纯化的标签，利用其在真核表达系统中高表达及与配体ATF高亲和性的特点，可建立目标蛋白表达与纯化的高效、廉价方法。但天然的suPAR自身结构比较灵活，可能与目标蛋白相互干扰，不适于用作融合蛋白标签进行目标蛋白的高效表达和纯化，故而我们采用了suPAR的一种构象稳定突变体suPAR^H47C/N259C(suPARcc)来进行本研究。

发明内容

本发明的目的在于发明尿激酶受体稳定突变体suPARcc作为融合标签在真核胞外蛋白表达中的应用，该融合标签在提高重组蛋白在真核细胞表达量的同时，可高效地捕获重组蛋白。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述尿激酶受体稳定突变体suPARcc，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在真核细胞表达载体多克隆位点的最前端插入suPARcc和常见的蛋白酶位点，将目标蛋白基因克隆在多克隆位点中。当suPARcc-目标产物融合蛋白在真核表达体系中表达之后，利用ATF对suPARcc的高结合力，采用ATF亲和柱对融合蛋白进行纯化，然后利用常见的蛋白酶将目标产物释放和分离。同时suPARcc也可以作为融合蛋白标签融合在目标产物的羧基端(即目标产物的下游)进行表达，融合表达产物可以采用ATF亲和柱进行纯化，然后利用常见的蛋白酶将目标产物释放和分离。