[发明专利]高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌及其应用

权利要求书

1.高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌，其特征在于，所述工程菌为多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）CA10-W，保藏编号为CGMCC No. 19850。

2.权利要求1所述工程菌在发酵制备CA10病毒样颗粒中的应用。

3.CA10病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）培养权利要求1所述工程菌，从而在工程菌细胞内表达CA10病毒P1蛋白和3CD蛋白，并自组装成具有免疫原性的病毒样颗粒；

2）分离纯化所述病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）采用超滤、三步层析工艺进行病毒样颗粒的分离纯化，包括：

A、离心收集菌体，破碎菌体，目的产物澄清后进行超滤，收集超滤液；

B、离子交换层析；

C、羟基磷灰石层析；

D、分子筛层析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A中破碎菌体的方法包括：将工程菌采用细胞裂解缓冲液重悬，在压力1100~1400 bar的条件下破碎细胞2-4次；所述细胞裂解缓冲液为20~100 mM Tris，1~5 mM EDTA-Na2，200~1000mM NaCl，1~5 mM PMSF，0.01%~1.0%吐温-80，pH7.5~8.5；

目的产物澄清的方法包括：破碎后的细胞破碎液通过深层滤器过滤，过滤流速为900~1850ml/min/m²，采用洗液洗滤膜包，收集澄清液；所述洗液为20~100 mM Tris，1~5mMEDTA-Na2，200~1000mM NaCl，0.01%~1.0% 吐温-80，pH7.5~8.5；或者

将破碎后的细胞破碎液以6000~8000rpm离心40~60min，收集澄清液；或者

破碎后的细胞破碎液通过0.65μm膜包进行微滤，收集澄清液；

超滤的方法包括：收集的澄清液以100~500KD的膜包采用pH7.0~8.5的缓冲液进行超滤，收集超滤液；所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷20~100 mM，NaCl 150~300mM和重量百分比为0~10%的甘油水溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，破碎菌体的方法包括：将工程菌在压力1300bar的条件下破碎细胞2次。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，缓冲液pH为8.0，三羟甲基氨基甲烷为50mM和NaCl为250mM，缓冲液中还包含质量分数为5%的甘油水溶液。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤B包括：采用缓冲液平衡5~10个柱体积后上样，收集穿透液UV280nm紫外吸收峰，即为一步层析蛋白液；所述缓冲液为20~100 mM三羟甲基氨基甲烷，NaCl 150~300mM和重量百分比为0~10%的甘油水溶液，pH7.5~8.5；采用阴离子交换层析柱进行离子交换层析，介质为Capto Q。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用50 mM三羟甲基氨基甲烷、250mM NaCl和重量百分比为5%的甘油水溶液形成pH8.0的缓冲液进行平衡洗脱。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤C包括：向一步层析蛋白液中加入500mM PB溶液至终浓度为10~120 mM PB；以10~120mM PBS和重量百分比为0~10%的甘油水溶液形成pH6.8~8.5的缓冲液平衡，平衡5~10个柱体积后上样，再用150-400mM PBS和重量百分比为0~10%的甘油水溶液形成pH6.8~8.5的缓冲液洗脱，收集洗脱液UV280nm紫外吸收峰，即为二步层析蛋白液。