[发明专利]无创鉴定昆虫基因型的方法

说明书

本发明提供了一种无创鉴定昆虫基因型的方法。包括以下步骤：（a）将野生型昆虫和基因编辑的昆虫突变体分别进行饲养，每个昆虫个体需要独立标记或单独饲养；（b）以昆虫每蜕一次皮视为龄期增长一次，分别收集对应昆虫1龄至成虫期的蜕皮；（c）利用DNA提取试剂盒提取蜕皮的基因组DNA；（d）以蜕皮中提取的基因组DNA为模板，根据目的基因序列设计引物并进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，进而鉴定基因型。本发明利用蜕皮可实现无创、早期、重复的昆虫基因型鉴定，解决了剪取虫体组织带来的机械性损伤以及幼龄期虫体无法鉴定的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种无创鉴定昆虫基因型的方法。

背景技术

近年来，随着对基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究的不断深入，该系统以其操作简易、省时、高效等优点被广泛应用于众多生物学研究领域，特别是对飞蝗(Locusta migratoria)、果蝇(Drosophilidae)、家蚕 (Bombyx mori)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)等多种昆虫的研究中。在运用CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术对昆虫进行基因组编辑后，对所编辑个体的基因型鉴定就显得尤为重要。

当前，鉴定昆虫突变体所需的样本组织主要以昆虫全身或局部组织为材料提取基因组DNA。例如，在已公开的文献中，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致乏库蚊(Culex quinquefasciatus)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、小菜蛾(Plutella xylostella)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)的基因编辑实验多采用从胚胎中提取其基因组DNA的方式；在柑橘凤蝶(Papilio xuthus)、小红蛱蝶(Vanessa cardui)和鹿眼蛱蝶(Junonia coenia)等鳞翅目昆虫中，多以头部、胸部、复眼和翅膀肌肉组织等局部组织为作为提取DNA的样品，用以鉴定突变体的基因型。而在飞蝗中，也主要是以提取飞蝗前足前附节或血淋巴中的基因组DNA，从而完成基因型的鉴定。

这些传统鉴定技术会对昆虫个体带来不可逆的机械损伤，甚至造成个体死亡，不利于突变体表型的观察。此外，由于幼龄期的昆虫较为脆弱，极易死亡，因此现有方法都不适用于昆虫基因型的早期鉴定，仅对成年期昆虫伤害较小，因此在利用CRISPR/Cas9进行基因编辑后，需要大量饲养突变个体至成虫，时效性较差且易于造成时间和资源浪费。飞蝗为世界性农业害虫，也是典型的渐变态类昆虫。近期，一场大范围的蝗灾已席卷了全球20多个国家，对粮食安全造成了严重后果。近年来，以飞蝗基因组测序完成为契机，探索害虫防治新型分子靶标成为研究热点。结合CRISPR/Cas9技术在细胞水平对靶标基因功能进行初验证，为后续在活体水平研究提供基础数据，是完成对害虫靶标基因的筛选和验证的主要途径。如何在无创的条件下完成对飞蝗个体基因型的鉴定是保证实验表型初步筛选的关键。

发明内容

本发明的目的就是提供一种无创鉴定昆虫基因型的方法，以解决现有鉴定方法会对虫体带来机械性损伤，幼龄期虫体会因机械损伤死亡而无法进行早期鉴定以及基因型鉴定的准确性不理想的问题。

本发明的目的是这样实现的：一种无创鉴定昆虫基因型的方法，包括以下步骤：

（a）将野生型昆虫和基因编辑的昆虫突变体分别进行饲养，每个昆虫个体需要独立标记或单独饲养；

（b）以昆虫每蜕一次皮视为龄期增长一次，分别收集对应昆虫1龄至成虫期的蜕皮；