[发明专利]硫酸皮肤素裂解酶及其应用

说明书

本发明涉及硫酸皮肤素裂解酶及其应用。本发明中的硫酸皮肤素裂解酶DLase降解硫酸皮肤素的酶活力为800～1800U/mg，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明涉及的硫酸皮肤素裂解酶DLase具有更高的降解硫酸皮肤素活性，解决了现有技术中硫酸皮肤素专一性降解酶酶活低不利于大规模生产应用的问题，同时具有更好的温度稳定性，本发明的硫酸皮肤素裂解酶DLase为内切型酶，可用于CS/DS相关样品中DS组成结构的特异性分析、DS组分的选择性降解去除、DS寡糖的制备以及相关产品的质量控制分析等。

技术领域

本发明涉及硫酸皮肤素裂解酶及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfates,CS)/硫酸皮肤素(Dermatan sulfates,DS)是一种主要类型的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)，它们通过连接序列(-GlcUA-Gal-Gal-Xyl-O-Ser)共价连接在核心蛋白上组成蛋白聚糖(Groteoglycans,PGs)(Lindahl,U.1965)，广泛分布在细胞表面以及细胞外基质中，参与细胞的各种生理病理过程，包括神经系统的发育(Faissner,A.1994,Clement,A.M.1998)、损伤修复(Trowbridge,J.M.2002)、细胞分裂生长、细胞间信号转导等过程(Nandi,S.2006,Taylor,K.R.2006)。这些多样化的功能归因于CS/DS结构的多样性。CS由D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid,GlcUA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(N-acetyl-D-galactosamine,GalNAc)组成的二糖单位重复连接而成。D-葡萄糖醛酸在C-5差向异构酶的作用下变为L-艾杜糖醛酸(L-iduronicacid,IdoUA)而变成了DS(Maccarana,M.2006)。因此CS与DS链经常以CS-DS共聚结构存在于哺乳动物组织中(Izumikawa,T.2004,Cheng,F.1994)。在生物合成过程中，CS/DS链通常会在GalNAc的C-4位和/或C-6位，和/或GlcUA/IdoUA的C-2位上被磺基转移酶进一步修饰，以形成独特的结构域。这些特定的结构域分布在特定的细胞组织中，与细胞因子、生长因子等各种蛋白相互作用参与机体的生理病理过程(Sugahara,K.2003)。因此研究CS/DS的特定结构对于其功能的研究十分重要。

CS与DS结构的异质性阻碍了其功能的研究，目前用于其结构分析的方法主要有核磁共振法(Nuclear magnetic resonance,NMR)与质谱法(Mass spectrometry,MS)(Linhardt,R.J.2006)。此外具有特定活性的CS/DS裂解酶也是用于CS/DS结构功能关系研究和制备生物活性寡糖的有效工具。这些裂解酶通过β-消除反应特异性切割GalNAc与GlcUA/IdoUA残基之间的1,4-糖苷键，从而在糖醛酸残基上产生一个在232nm具有特定紫外吸收的不饱和双键(Garron,M.L.2010)。在这些裂解酶中有些可以降解透明质酸(Hyaluronan,HA)，CS和DS，如来自Proteus vulgaris的商业化硫酸软骨素裂解酶ABC(CSase ABC)(Yamagata,T.1968)；有些可以特异性的切割CS/DS糖链中CS的GalNAcβ1-4GlcUA糖苷键，如来自Flavobaterium heparinum的CSase ACI和来自Arthrobacteraurescens的CSase ACII(Hiyama,K.1975)。

但目前仅有一个可以特异性的切割CS/DS糖链中DS的GalNAcβ1-4IdoUA糖苷键的酶CSase B被鉴定。该酶首先由Hoffman从F.heparinum中观察到，然后Michelacci和Dietrich对其进行了分离检测。2001年Pojasek克隆表达了F.heparinum中的CSase B(Pojasek K.2001)。除此之外，未见其它关于特异性降解DS的裂解酶相关报道。

发明内容