[发明专利]一种从牛胆汁中提取高纯度结合胆汁酸的方法

说明书

本发明公开了一种从牛胆汁中提取高纯度结合胆汁酸的方法。以牛胆汁为原料，利用CTAB能与黏多糖类物质形成沉淀而去除黏多糖类物质，利用Zn²⁺和Ca²⁺等金属离子在碱性条件下能与大多数蛋白质反应形成沉淀而去除大部分蛋白质类物质。大部分结合胆汁酸主要以钠盐的形式存在牛胆汁中，在pH为酸性的情况下，转化为结合胆汁酸，因不溶于水而沉淀，收集得到粗胆汁酸类物质。通过层析分离的方法，得到不同种类的高纯度结合胆汁酸。通过本发明的方法获得的结合胆汁酸在产量和纯度方面符合人工合成牛黄的工业化大规模生产要求。

技术领域

本发明属于制药技术领域，尤其涉及利用现代分离纯化技术方法从牛胆汁中获取高纯度结合胆汁酸的方法。

背景技术

牛黄即牛胆结石，胆汁酸是其多种有效成分中的一类，胆汁酸分为结合胆汁酸和游离胆汁酸，其中结合胆汁酸如牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸有抗菌、消炎等药理作用，其含量高低是区别优质或劣质牛黄的重要指标之一。

天然牛黄是自然形成的产物，质量难免存在差异，其结合胆汁酸的含量存在较大的差异，而优质的天然牛黄总结合胆汁酸含量3～7％，如优质的澳洲牛黄(结合胆汁酸含量见表1)。目前市售商品化的结合胆汁酸多为化学合成，大多数合成过程中使用的部分有机溶剂刺激性强，易对人员和环境造成不利影响，产生的一些结构相近的杂质很难去除，纯化困难，影响人工合成牛黄的功效。化学合成胆汁酸的种类不够丰富，没有甘氨去氧胆酸，无法保证人工合成牛黄的功效。现有从动物胆汁中层析分离纯化的技术，仅仅获得了牛磺胆酸和甘氨胆酸，且产量低。使用的溶剂有的毒性大，有的不易回收污染环境，不适合工业化大生产。

表1优质澳洲牛黄结合胆汁酸含量统计表

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种从牛胆汁中提取高纯度的结合胆汁酸且适合大批量工业化生产的方法。采用现代分离纯化技术从牛胆汁中获取四种高纯度结合胆汁酸，解决了现有化学合成法和层析分离纯化法的各种问题，所用溶剂安全性好、易回收、价格低廉，工艺步骤简单，产量高，产品纯度高，种类齐全，适合大批量工业化生产，能有效保证人工合成牛黄的功效。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种从牛胆汁中提取高纯度结合胆汁酸的方法，所述结合胆汁酸为牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸，以牛胆汁为原料进行以下处理：

①黏多糖的去除：每升牛胆汁中加入80～120ml 0.02％的CTAB溶液，搅拌4～6min，静置20～40min，过滤去除沉淀，得滤液；

②蛋白质的去除：用氢氧化钠将步骤①的滤液pH调至碱性，向每升滤液中加入15～25ml 0.02％的硫酸锌或氯化锌溶液，15～25ml 0.01％的氯化钙或硝酸钙溶液形成金属盐类复合物，过滤去除沉淀，得滤液；

③结合胆汁酸混合物的获取：用浓盐酸将步骤②中滤液pH调至酸性，搅拌2～5min，静置20～40min，离心收集沉淀物；

④结合胆汁酸的分离：将步骤③收集的沉淀物与硅胶以(5～6):(3～4)的比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径17～25cm，装柱硅胶量4～6kg，高度30～40cm；以乙酸乙酯/甲醇/甲酸为洗脱液进行洗脱，洗脱速度5～8ml/s。

优选的，上述步骤②中，调节步骤①中滤液pH的碱性范围为：10～10.5，所述步骤③中，调节步骤②滤液pH的酸性范围为：1～2。

优选的，上述步骤④中，将步骤③收集的沉淀物与100-200目硅胶以5:4的比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱硅胶量5kg，装柱100-200目硅胶高度35cm。