[发明专利]一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法

说明书

本发明属于蛋白质富集技术领域，涉及一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法。用AHA标记细胞，提取全蛋白；取细胞全蛋白和炔基树脂通过click反应连接；用不同的缓冲液洗涤非特异吸附的蛋白质，以除去非特异性吸附的蛋白质；用胰蛋白酶酶切释放目标肽段；收集样品进行质谱分析。与现有技术相比，本发明通过生物标记、选择性共价键合、严格洗脱条件及选择性解离，实现对新合成低丰度蛋白质的高选择性富集，结合nano‑LC‑MS/MS能够实现大规模分析鉴定蛋白质，根据增加的质量标签可以进一步指认新生蛋白质。本方法为新生蛋白质的高效富集和准确指认提供了高效的方法，广泛用于低丰度的新生蛋白质组学的研究领域。

技术领域

本发明属于蛋白质富集技术领域，尤其是涉及一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法。

背景技术

在不同病理状态或药物干扰的情况下，新生蛋白质的发现在揭示疾病发生机制、发现药物作用过程的解释中都具有极为重要的意义。然而，在复杂的生物样品中，新生蛋白质没有标记，很难区分新生蛋白质和已经存在的蛋白质，同时新生蛋白质的丰度极低，通过常规方法很难直接检测到。

目前，新生蛋白质富集的方法中BONCAT(PNAS,2006,103:9482-87；NatureProtocols,2007,2:532-540)应用最广，后期发展的QuaNCAT(Nature Methods,2013,10:343-46)方法结合了SILAC技术可以富集同时定量新生蛋白质，最近发展的HILAQ(J.Proteome Res.,2017,16:2213-2220；Nature Protocols,2018,13:1744–1762)技术结合了轻重同位素AHA富集并定量新生蛋白质。以上这些方法都是借助生物素(biotin)和链霉亲和素(avidin)的亲和富集，主要步骤是通过click反应将生物素接到含有AHA的新生蛋白质上，使新生蛋白质带上生物素标签从而富集。在生物医学领域，利用生物素和链霉亲和素的亲和相互作用进行富集得到了广泛应用。但是这种技术存在的问题有：(1)由于生物素和链霉亲和素之间是非共价作用，不能用比较强烈的条件进行洗涤，往往造成非特异吸附蛋白的干扰严重，如果洗脱条件很剧烈则回收率低；(2)富集后肽段带有生物素基团，生物素分子会影响色谱分离且降低肽段的离子化效率，严重影响蛋白质的鉴定。

发明内容

本发明基于背景技术中BONCAT、QuaNCAT和HILAQ方法存在的缺陷，而提供一种新的特异性可逆富集新生蛋白质的方法。

本发明是基于生物正交反应的可逆富集方法检测细胞中的新合成蛋白质。

本发明设计并合成炔基肽段键合到树脂材料制备得炔基树脂，炔基树脂结构稳定、富集容量高、分离方便可靠。该炔基树脂用于富集AHA标记的新生蛋白质，这一技术使得新生蛋白的研究更加便捷、更高通量。

本发明的方法高效、简便、可逆富集，能够在新生蛋白富集鉴定中广泛应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种炔基树脂的制备方法，具体为：将炔基肽段与醛基树脂通过还原烷基化反应连接，合成炔基树脂，所述炔基树脂表示为alkyne-resin。

进一步地，所述炔基肽段为GLGAGLLAR(aPra)，其氨基酸序列为GLAGLLAR(L-Pra-NH₂)。

其中，L-炔丙基甘氨酸简称为L-Pra，将L-Pra的羧基端经过氨基化处理，保护肽段末端活性羧基，可以避免羧基端潜在的副反应。经酰胺化的L-炔丙基甘氨酸表示为L-Pra-NH₂，简称为aPra，为一整体结构，所以放在括号中进行表示为(aPra)，即该结构含有炔基用于后续的生物正交反应。