[发明专利]基于多重PCR-飞行时间质谱检测34种呼吸道病原微生物的引物和探针组合及试剂盒

说明书

本发明提供了基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的引物和探针组合，所述的引物和探针组合包括，1）引物序列组合，如表1所示；2）探针序列组合，如表2所示。本发明还提供了基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的试剂盒。本发明中，基于MassARRAY MALDI‑TOF MS系统，除了对多种呼吸道病原体可以同时进行检测，还可以对2019新型冠状病毒（2019‑nCoV）进行分型鉴定，这样对临床和病毒研究更加有意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测34种呼吸道病原微生物的方法、配套引物/探针组合及试剂盒、以及这种检测方法在呼吸道病毒感染上的应用。

背景技术

呼吸道感染疾病，尤其是急性呼吸道传染病，一直是全球致死、致残的重要病因，在世界范围内受到广泛关注。病毒是造成呼吸道感染疾病最主要的原因，50％以上的呼吸道感染是由病毒引起。常见的呼吸道感染病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、冠状病毒等。甲型流感病毒可以感染人和哺乳动物以及禽类，H1N1、H2N2、H3N2 亚型主要感染人类，其它亚型主要是感染禽类以及猪、马和水生哺乳动物；在禽流感病毒中能够感染人类的亚型有H5N1、H7N1、H7N2、H7N4、H7N9、 H9N2、H10N8等12种。乙型流感病毒主要在人群中流行，没有亚型分类，其流行规模比甲型流感病毒要小。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是副粘病毒科肺病毒属中单链RNA病毒，分为A、B两型，是 5岁以下婴幼儿呼吸道感染的最主要病因，我国2岁以下住院和门/急诊病例中，RSV检出率高居榜首，达33.3％[参见Yu J，et al.Comparison of the prevalence ofrespiratoryviruses in patients with acute respiratory infections at differenthospitalsettings in North China，2012-2015.BMC Infect Dis.2018Feb 8；18(1)：72]；此外，RSV还能感染其他各个年龄组的人群，并导致严重的呼吸道疾病，其病情在老年人中尤为严重。副流感病毒(PIV)属于副粘病毒科(paramyxiviridae)，副粘病毒亚科(paranyxivirinae)，可引起各年龄阶段人群发病，尤其以婴幼儿易感，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒。腺病毒 (Adenoviruses，ADV)是腺病毒科哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)的一种，可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等，并引起广泛的临床症状。人偏肺病毒(Human metapneumovirus，hMPV)是五岁以下婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，通常可与RSV、流感病毒等共感染，导致儿童的临床症状加重。人博卡病毒(Bocavirus)是细小病毒科细小病毒亚科的一个属，通常感染肠道和呼吸道，由瑞典科学家运用分子病毒筛查方法于2005年首次在儿童呼吸道分泌物中发现；作为与人类急性呼吸道感染密切相关的新型病毒，人博卡病毒与其他呼吸道病毒的共感染率可高达51％，通过空气传播，容易使婴幼儿罹患肺炎、支气管炎和支气管肺炎等疾病。人肠病毒(HEV) 是一种主要寄生于肠道的正链单股RNA病毒，具高传染性，主要经由吃到被污染的食物、水等或经由呼吸道(飞沫、咳嗽等)传染；大部分的HEV感染临床症状都是轻微的类流感症状，表现为发烧、喉痛、头痛、恶心等。人鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)是小RNA病毒科、鼻病毒属的一种，是人患普通感冒的主要病原，感染人群主要为老年人和5岁以下儿童，尤其多发于1岁以下儿童。柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种肠病毒(enterovirus)，分为A和B两类，是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是介于细菌与病毒之间，无细胞壁的一类原核细胞型生物，是引起儿童气管炎、支气管炎、原发性不典型肺炎的重要病原体。