[发明专利]一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法

说明书

本发明提供一种利用多壁碳纳米管促进椒样薄荷愈伤组织诱导的方法，包括如下步骤：1)以茎尖为外植体，进行初代培养以获得无菌苗；2)切取无菌苗的带芽茎段接种于愈伤组织诱导培养基，所述愈伤诱导培养基含有50～250mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。本发明提供的方法可以提高椒样薄荷愈伤组织诱导率，缩短诱导周期，同时得到的愈伤组织质量好，无褐化现象，能够快速分化出不定芽。促进愈伤组织发生和生长的MWCNTs浓度范围应控制在50～250mg/L，优选浓度为100mg/L，在该浓度下椒样薄荷愈伤组织诱导率可达100％，愈伤组织鲜重可比对照提高93％。

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种促进椒样薄荷(Mentha×piperitaL.)愈伤组织诱导的方法。

背景技术

椒样薄荷(Mentha×piperita L.)是唇形科薄荷属的多年生草本植物，椒样薄荷精油清香凉爽，具有刺激大脑、振奋精神和提升注意力、缓解刺激和瘙痒和改善消化系统等功能，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域，因此具有较高的经济价值。椒样薄荷由绿薄荷(Mentha spicata)与水薄荷(Mentha aquatica)杂交而成的一个不育性中间类型。长期以来主要以扦插、分株等方式进行繁殖，这种传统的繁殖方式容易使植物感染病毒，从而引起品种的退化和产量、质量的下降。近年来，薄荷油市场的需求不断扩大，而栽培面积却逐年递减，使得薄荷油价格正逐步上升。

组织培养因具有不受环境、时间等外界因素的影响和高效等特点，被广泛的运用于植物的规模化生产和科学研究中，在组织培养体系中诱导愈伤组织是实现快速繁殖的重要手段，愈伤组织也可以作为细胞悬浮培养生产次生代谢产物的原材料，此外愈伤组织还是诱变育种的常用材料。通过组培快繁的方式进行脱毒复壮，是在短期内获得大量的无菌苗、满足日益增长的椒样薄荷精油市场的有效方法。目前椒样薄荷的组织培养方法已有一些报道，《椒样薄荷的组织培养研究》(王小敏等，2007)以茎尖作为外植体通过诱导不定芽建立了椒样薄荷的组织培养体系，《椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变》(胡燕梅等，2018)报道了基本培养基、植物生长调节剂组合及抗褐变剂对椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变的影响。CN102630564A《一种耐盐薄荷的组培快繁方法》公布了一种以耐盐椒样薄荷的茎段为外植体诱导愈伤组织、不定芽增殖、生根，最后驯化移栽的组培快繁方法。

近年来，碳纳米管在植物生物学上的应用是目前纳米生物学研究的前沿课题之一。已有一些研究表明，碳纳米管可以促进植物愈伤组织的诱导，认为纳米材料穿透细胞壁，带动植物生长调节剂，加速脱分化和愈伤的形成。碳纳米管在植物组织培养领域的应用近年来已有一些报道，如专利《一种早梨愈伤组织诱导和分化的方法》、《一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法》、《一种木本药用植物愈伤组织的发生和生长的培养基及其应用》等，均为在组织培养体系的某个或某些环节中加入一定浓度的碳纳米材料，进而提高组培效率。

愈伤诱导是椒样薄荷能在短期内获得大量无菌苗的关键环节，但由于薄荷组织中存在大量的酚类物质，容易使诱导出的愈伤产生褐变，诱导得到的愈伤组织体积较小，诱导周期较长，不同激素配比下的诱导效果差异大。《椒样薄荷的组织培养研究》(王小敏等，2007)建立的组织培养体系为通过诱导不定芽途径，该体系仅产生少量愈伤组织或产生的愈伤组织不能分化形成不定芽，且该研究发现以叶片为外植体建立再生体系比较困难。《椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变》(胡燕梅等，2018)报道了基本培养基、植物生长调节剂组合及抗褐变剂对椒样薄荷叶片愈伤组织诱导与抗褐变的影响，然而该文献得到的愈伤组织可能适用于细胞悬浮培养生产次生代谢产物，但不合适应用于脱毒复壮和诱变育种。CN102630564A《一种耐盐薄荷的组培快繁方法》公布的方法并没有公开能从愈伤组织分化出不定芽。根据该专利所公开的内容，薄荷植株去叶留茎和芽点，截取3cm的茎段，所述的不定芽是茎段中芽点萌发增殖而成，并非愈伤组织分化出的不定芽。而芽点萌发与愈伤组织分化的不定芽形态建成完全不同。