[发明专利]厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用

说明书

本发明提供了一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用，厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因为RPS23、CYTB5、EF‑1α和α‑Tubulin，RPS23基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，CYTB5基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，EF‑1α基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，α‑Tubulin基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；本发明从4个常用候选内参基因中筛选得到2个在不同发育阶段中表达相对最稳定的内参基因，以应用于厚壳贻贝不同发育阶段幼体的基因表达分析研究，从而为厚壳贻贝不同发育阶段幼体实验中功能基因表达的精确定量提供有力保证。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)隶属软体动物门双壳纲贻贝目，是一种近海暖温性的底栖贝类，是我国继牡蛎、蛤和扇贝后的第四大海产贝类。贝类养殖不仅满足消费者对于鲜活、优质海产品的需求，同时对国家蓝色海洋可持续发展起着非常重要的作用。厚壳贻贝作为附着性贝类，幼体时期需要经历一个附着和变态的过程，也是其从浮游幼虫的生活方式转变为底栖生活方式的重要转变过程。幼体的变态过程主要由外界环境因子和内源性因子所控制，关于外界环境因子如海洋微生物被膜、海洋细菌被膜和人工诱导物等已有大量的研究报道。近年来，在分子水平阐明幼虫变态发育的调控机制受到科学家们的广泛关注。实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)是一种定量检测目的基因表达的技术，可以捕捉到PCR扩增反应中每个循环产物产生的荧光信号，完成定性以及定量分析。与传统的PCR技术相比，它具有高精确度、强特异性、快速检测和重复性好等优点。

内参基因是指在对某一个目的基因进行定量研究时，在不同实验条件下都能在待测样品中实现稳定表达的一类基因，其作用是校正目的基因的定量过程。这些内参基因一般都是管家基因，在细胞内可以稳定表达，从而有助于细胞各种功能的实现。在进行qRT-PCR过程中，待测样品可能会在反转录效率上存在差异，所以需要选择可以稳定表达的内参基因作为校正标准。

公开号为CN104073557A的专利中，筛选出的β-actin、GAPDH和RS18是Poly(I:C)应激实验中，牡蛎血细胞内表达最稳定的3个内参基因，因此可以同时使用做为荧光定量内参基因。此外，一些内参基因只在特定时期或处理条件下稳定表达。发育时期或处理条件不同，常用内参基因的表达就会产生巨大差异。因此，对于不同的实验条件和样本类型，需要不同的内参基因。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因，即筛选厚壳贻贝(Mytilus coruscus)不同生长发育阶段的荧光定量内参基因。基于荧光定量PCR中的绝对定量法在厚壳贻贝不同生长发育阶段相关实验中对其他功能基因进行定量分析所需的内参基因及其引物序列，从而筛选出稳定表达的内参基因，进一步大大提高qRT-PCR定量的准确性。

本发明的第二个目的是提供一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因的引物。

本发明的第三个目的是提供一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因和引物的应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因，荧光定量内参基因为RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin，RPS23基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，CYTB5基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，EF-1α基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，α-Tubulin基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：