[发明专利]一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法

权利要求书

1.一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得甘草无菌苗： 选用籽粒饱满的甘草种子，用浓硫酸腐蚀处理30-60分钟后，用清水冲洗干净，再用质量浓度为75％的乙醇表面消毒30s，无菌水洗涤2次，然后在1-3％的次氯酸钠溶液中浸泡10-20min，浸泡期间充分摇晃，之后再用无菌水洗涤3-5次，每次不少于1min；将洗涤好的种子接种到添加30g· L^-1蔗糖、6g· L^-1琼脂的MS基本培养基中，pH值6.0，在温度25℃±2℃，光照强度2000-4000Lux，光照时间16h/d的光照条件下培养25-30d，种子萌发生长，下胚轴长至2-3cm，子叶展开即可获得甘草无菌苗；

(2)诱导愈伤组织： 选取步骤(1)中正常茁壮生长的甘草无菌苗，将下胚轴切段、子叶切块，接种到愈伤组织诱导培养基上；在温度为25℃±2℃的无菌条件下黑暗培养25-30d，完成继代培养一次，获得甘草愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5-1mg· L^-1萘乙酸、0.5-2mg· L^-16-苄氨基嘌呤、0.2-1.0mg· L^-1 2，4-二氯苯氧乙酸、25-30g· L^-1蔗糖及5-6g· L^-1琼脂，pH值5.5-6.0；

(3)建立甘草细胞悬浮培养体系： 选取步骤(2)中生长旺盛、表面干燥、质地松散的浅黄色愈伤组织，接种到细胞悬浮培养基中，接种量即愈伤组织鲜重/液体培养基体积为30-60g· L^-1，然后置于摇床，摇床转速100-120rpm，黑暗培养20-25d，结束一个继代培养周期，然后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤,除去大细胞团块，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的细胞悬浮培养基进行继代培养，如此反复，连续继代培养3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的甘草细胞悬浮培养系；所述细胞悬浮培养基为：在MS基础培养基中添加0.5-1mg· L^-1萘乙酸、0.2-1mg· L^-16-苄氨基嘌呤、0.2-0.5mg· L^-1 2，4-二氯苯氧乙酸，30-40g· L^-1蔗糖，pH 5.5-6.5；

(4)诱导悬浮培养体系细胞中甘草酸的积累： 收获步骤(3)中所述甘草悬浮培养体系中的甘草细胞，转接到高产甘草酸的诱导培养基中进行培养,培养至第8-10天，在高产甘草酸的诱导培养基中添加经过滤灭菌的40％蔗糖溶液，使蔗糖浓度恢复到30g-40g· L^-1，继续培养，培养至第16-18天，在高产甘草酸的诱导培养基中加入经过滤灭菌的浓度为50-100μmol· L^-1的茉莉酸甲酯，培养至20-22天结束培养，得到完成甘草酸积累的甘草细胞；所述高产甘草酸的诱导培养基为：在步骤(3)所述的细胞悬浮培养基中，添加50-100μmol· L^-1NaCl，1-2mg· L^-1钼酸钠。

2.根据权利要求1所述的提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法，步骤(2)中的接种方法为：下胚轴横放于愈伤组织诱导培养基上，轻按使切口两端充分接触愈伤组织诱导培养基；子叶平铺于愈伤组织诱导培养基表面。