[发明专利]一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法及处理试剂盒

权利要求书

1.一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）胶内酶解：将蛋白质凝胶电泳的待检测泳道部分细碎化后，经洗涤、蛋白质还原处理、蛋白质烷基化处理、蛋白酶酶解处理后，采用酸性乙腈溶液进行肽段抽提，获得肽段-酸性乙腈溶液；所述酸性乙腈溶液，含有3%至10%的甲酸，乙腈浓度在50%至80%之间；

（2）肽段脱盐：将步骤（1）获得的肽段-乙腈溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的反相色谱填料的分离柱，采用质量分数0.1%-0.5%的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，并采用碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，作为质谱检测进样样品；所述反相色谱填料为SDB-RPS反相色谱填料；所述碱性乙腈溶液，含有1%-3%的NH₄OH；乙腈浓度在60%至90%之间；

所述反相色谱填料，具有阳离子交换作用，当溶液pH值呈酸性，肽段带有正电荷从而与反相色谱填料稳固吸附，进行脱盐洗涤后，通过洗脱液改变环境pH值，使得肽段不再带有正电荷，从而溶解在呈碱性的洗脱液中被洗脱。

2.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述分离柱被包含于肽段除盐装置中；所述肽段除盐装置，由可拆卸嵌套的分离柱、适配器和收集管组成；所述分离柱为两端开口的锥形管，距离下端3至8 mm处填充有反相色谱填料；所述收集管，采用1.5 mL的离心管；所述分离柱和收集管通过适配器同心固定，所述适配器为中心具有锥形通孔且与收集管配合的收集管盖，所述锥形通孔与分离柱配合，使得分离柱与收集管同心固定，且分离柱一端暴露在适配器外，一端处于收集管内部。

3.如权利要求2所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述适配器具有通气孔，用于平衡收集管内外气压。

4.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述采用三氟乙酸进行脱盐洗涤的操作具体为：加入120-180 μL含有0.1%-0.5%的三氟乙酸溶液至吸附有待脱盐肽段的分离柱，过柱后弃液；洗涤操作重复1至3次；

所述采用碱性乙腈溶液洗脱的操作具体为：加入15-20 μL的碱性乙腈溶液至吸附有已脱盐肽段的分离柱，过柱后收集液相；洗脱操作重复2至3次。

5.如权利要求2或3所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，所述脱盐洗涤的操作和所述洗脱的操作过柱步骤，采用所述可拆卸嵌套的分离柱、适配器和收集管组成的肽段除盐装置，并采用离心力加速液体过柱，采用1000 g-3000 g离心1-3 min。

6.如权利要求1所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，步骤（1）所述蛋白质还原处理和蛋白质烷基化处理按照以下方法同时进行蛋白质还原和烷基化处理：

加入凝胶体积1至3倍的还原烷基化反应液，50 ℃-95 ℃孵育20-60 min；所述还原烷基化反应液含有还原剂三(2-羧乙基)膦、以及烷基化剂氯乙酰胺，其中TCEP浓度在5-30 mM之间，CAA浓度在20-100 mM之间。

7.如权利要求6所述的蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理方法，其特征在于，向胶块中加入2倍胶块体积的还原烷基化反应液，56 ℃孵育30 min，所述还原烷基化反应液含有10mM TCEP和40 mM CAA的水溶液。

8.一种蛋白质凝胶样品的质谱检测前处理试剂盒，其特征在于，包括：肽段抽提液、脱盐清洗液、脱盐洗脱液、以及具有阳离子交换作用的反相色谱填料的分离柱；

所述肽段抽提液，为酸性乙腈溶液，乙腈浓度在50%至80%之间；含有3%至10%的甲酸；

所述脱盐清洗液，为0.1%-0.5%的三氟乙酸进行脱盐洗涤；

所述脱盐洗脱液，为碱性乙腈溶液，乙腈浓度在60%至90%之间；含有1%-3%的NH₄OH；

所述肽段抽提液、脱盐清洗液、以及脱盐洗脱液的体积比为：1:0.5-1.5:0.05-0.2；

所述反相色谱填料为SDB-RPS反相色谱填料。